人羊膜間充質干細胞培養方法的改進*

崔冬冰， 范安然， 何志旭

(貴州醫科大學 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州 貴陽　550004)

?

人羊膜間充質干細胞培養方法的改進*

崔冬冰， 范安然， 何志旭**

(貴州醫科大學 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 建立一種高效分離培養人羊膜間充質干細胞的方法。方法： 分別用酶消化法、傳統組織塊貼壁法和改進的組織塊貼壁法分離出hAMSCs，觀察3種方法所獲得hAMSCs細胞形態、獲得時間，流式細胞學檢測其免疫表型；并用不同的誘導體系將hAMSCs向成骨細胞、成神經細胞進行誘導分化，鑒定其分化潛能。結果： 改進的組織塊貼壁法獲得hAMSCs細胞的純度更高，傳代次數更多，相同的培養時間里，獲得的細胞數量是酶消化法的3～4倍，是傳統組織塊貼壁法的1～2倍；hAMSCs細胞高表達CD73、CD90、CD44和CD105，不表達CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR；茜素紅染色和神經元特異性烯醇化酶檢測證實hAMSCs細胞可誘導分化為成骨細胞和神經細胞。結論： 改進的hAMSCs分離培養方法可獲得較大數量細胞，且保留了向神經細胞或成骨細胞可分化潛能。

[關鍵詞]人羊膜間充質干細胞； 細胞培養； 鑒定； 誘導

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有高度增殖和多向分化潛能的成體干細胞，來源廣泛，可從多個器官或組織中分離獲得，因具有低免疫原性等特點，而成為細胞療法的主要種子細胞，有著廣闊的應用前景[1]。目前已從骨髓、脂肪、肌肉、肺、肝、胰腺、羊水、胎盤[2-3]、臍血等組織或器官中分離獲得MSCs，胎盤的羊膜組織取材方便、易于分離獲得MSCs，不受倫理學限制，MSCs含量豐富等優勢受到研究者的青睞。目前，人羊膜間充質干細胞(human amnionmesenchymal stem cells，hAMSCs)的原代培養常采用酶消化法和傳統的組織塊貼壁法，但常常會因為操作時間長或是組織塊不能貼壁而影響hAMSCs的得率。因此，分離方法進行了改進，以求建立一種高效的本實驗對hAMSCs的分離培養方法。

1材料與方法

1.1標本

羊膜組織取自健康足月新生兒剖宮產手術后，經家屬和產婦知情同意并簽署《胎盤處理協議書》后捐獻所得。

1.2主要材料與儀器

L-DMEM(美國Gibco公司)、胎牛血清FBS(美國Hyclone公司)、0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)、1 g/L Ⅱ型膠原酶(美國Hyclone公司)及雙抗(青-鏈酶素混合液，美國Gibco公司)、Human MSC Analysis Kit(BD 562245)透氣式細胞培養瓶(NEST)、細胞計數板、超凈工作臺(蘇州凈化)、CO2細胞培養箱( 美國Thermo)、流式細胞儀(美國 Backman MoFlo XDP)、倒置顯微鏡(Nikon TE-2000)、低溫冷凍離心機(德國eppendorf 5810)及正置顯微鏡(美國Leica)。

1.3hAMSCs分離和培養無菌條件下剝離靠近臍帶處的羊膜組織， NS清洗并轉移至青霉素小瓶中，眼科剪剪成直徑約2.0 mm的組織塊。(1)酶消化法：在組織中加入1 g/L Ⅱ型膠原酶，37 ℃，12 h，然后再加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃，15 min，吸出上清并加入培養液(L-DMEM+10%FBS+1%雙抗)混勻， 1 000 r/min，3 min，沉淀用培養液重懸，轉入T75細胞培養瓶，37 ℃ 5% CO2培養箱中培養，隔日換液。(2)傳統組織塊貼壁法：將組織塊放入T75培養瓶中，每瓶放置10～12個，間隔0.5 cm，然后加入培養液培養，隔日換液。待見有細胞從組織塊周圍爬出時，隔日換液。(3)改進組織塊貼壁法：將組織塊放入T75培養瓶中，擰松瓶蓋，垂直地放在超凈工作臺上，干燥1～2 h后，加入培養液培養，隔日換液。

1.4觀察指標

1.4.1細胞生長情況從第3日起每日進行觀察，包括細胞出現的時間、細胞形態、細胞達到90%融合所需的時間，計數P1代hAMSCs培養第15天時的細胞數量。

1.4.2免疫表型鑒定按照流式檢測試劑盒使用說明操作，檢測P3代hAMSCs細胞膜表面分子：CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、CD105-Cy5.5和CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。

1.4.3分化潛能及鑒定取P3代hAMSCs細胞按2.0×103/cm2接種于六孔板中，并用神經細胞誘導劑(H-DMEM、 2% DMSO、200 μmoL/L丁羥基茴香醚)和成骨誘導劑(H-DMEM培養基、10 mmoL/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L 維生素C、10-8moL/L地塞米松)將hAMSCs分別向神經細胞和成骨細胞進行誘導培養，并用免疫組化法檢測神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和成骨結節。以未行誘導的hAMSCs作為對照。

1.5統計學方法

2結果

2.1細胞生長情況

2.1.1酶消化法接種后6 h左右有少量hAMSCs細胞貼壁，第3天可見細胞呈長梭形或多角形生長(圖1-A)，細胞融合達90%需要約18 d，傳代后細胞生長速度變緩，P1代培養第15天每T25培養瓶細胞計數為(3.8±0.28)×103個(表1，圖1-B)。

2.1.2傳統組織塊貼壁法接種第15天可見有組織塊周圍有少量hAMSCs細胞爬出，形態以梭形為主(圖1-C)，細胞融合達到90%需要約25 d，P1代培養第15天每T25培養瓶細胞計數為(10.3±0.50)×103個(表1，圖1-D)。

2.1.3改進組織塊貼壁法接種第10天可見hAMSCs細胞爬出，形態特征同上(圖1-E)，細胞融合達到90%需18 d，傳代細胞增殖迅速，P1代培養第15天每T25培養瓶細胞計數為(21.5±0.52)×103個(表1，圖1-F)。

2.2免疫表型鑒定

流式細胞學檢測結果顯示(圖2)，CD73和CD90表達量為97%、CD44和CD105表達量為95.4%；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR分子表達量為0.02% 。

注：A為酶消化法原代培養第3天；B為酶消化法P1代培養第15天；C為傳統組織塊貼壁法原代培養第15天；D為傳統組織塊貼壁法P1代培養第15天；E為改進組織塊貼壁法原代培養第10天；F為改進組織塊貼壁法P1代培養第15天圖1　hAMSCs的生長情況(×100)Fig.1　The growth situation of hAMSCs

圖2　第3代hAMSCs細胞表面分子(流式細胞)Fig.2　The flow cytometry detection of 3rd generation hAMSCs

2.3分化潛能鑒定

2.3.1hAMSCs向神經細胞誘導分化hAMSCs向神經細胞誘導4 h后，細胞形態上由長梭形變成三角形或多角形，并且有多個神經軸突，NSE檢測，DAB染色為黃色，表明hAMSCs具有向神經細胞分化的能力(圖3-B)。

2.3.2hAMSCs向成骨細胞誘導分化向成骨細胞誘導14 d后，細胞匯合聚集后呈多層重疊生長，形成成骨細胞特有的礦化結節，周圍折光性增強，茜素紅染色呈紅色，表明hAMSCs具有向成骨細胞分化的能力(圖3-C)。

注：A為對照組(100×)，B為向神經細胞誘導28 h(DAB，×400)，C為向成骨細胞誘導14 d染色(茜素紅，×40)圖3　hAMSCs誘導分化情況Fig.3　Differentiation experiment of hAMSCs

細胞生長特點hAMSCs酶消化法傳統組織塊貼壁法改進組織塊貼壁法細胞出現時間(d)3.00±0.2215.00±0.3210.00±0.44原代達到90%融合的時間(d)18.00±0.4525.00±0.2420.00±0.13P1代培養15d細胞數量(×103個)3.80±0.2810.30±0.5021.50±0.52

注：組間比較P<0.05

3討論

目前，關于hAMSCs的分離培養方法，文獻報道中各不相同，但主要包括酶消化法和組織塊法，這兩種方法分離培養出的MSCs形態特征、生長曲線、細胞表面標記物等無明顯差異。但各有利弊，酶消化法成本較高，操作比較繁瑣，污染概率大；消化過程時間過短，細胞很難爬出；消化時間過長易損傷細胞，影響細胞的增殖傳代能力[4]。

本研究通過采用酶消化法、傳統組織塊法和改進組織塊貼壁法從人胎盤羊膜中成功分離、培養出hAMSCs，觀察發現，酶消化法雖能在短時間內獲得細胞，但混有較多的雜細胞，消化時間難以控制，傳代后細胞不易貼壁，影響其增殖能力，相同的傳代培養時間能獲得的細胞數量較少。傳統組織塊貼壁法會有大量的組織塊不能緊貼在培養瓶底部，而已經爬出的細胞，由于數量少，不具備傳代的條件，長時間培養容易致細胞分化，相同的傳代培養時間里也不能獲得滿意的細胞數量。改進組織塊貼壁法可以使羊膜組織塊緊貼在瓶底，避免了組織塊漂浮，增加了細胞爬出的機會，縮短了原代培養的時間，確保了傳代細胞的活性和穩定性。

對于hAMSCs第1次傳代培養，通常都是按照1∶1或1∶2傳代，而這種方法常常因為細胞密度低而導致細胞貼壁難、數量少、需要延長培養時間，容易出現細胞分化現象，影響細胞質量，而本實驗用T75培養瓶進行原代培養，P1代傳至T25細胞培養瓶中，提高了接種密度，增加了貼壁細胞的數量，更有利于保持細胞的活性，加速細胞的增殖和傳代，其原因可能與改善了其生長的微環境，細胞通過自分泌和旁分泌途徑分泌相關細胞因子促進其生長[5]。

對于MSCs的鑒定一直沒有一個絕對統一標準，目前都是參照骨髓MSCs的鑒定標準來執行的，主要通過一般生物學特性、細胞表面標記物、多向分化潛能等途徑進行鑒定。hAMSCs能表達多種細胞表面抗原，包括CD13、CD29、CD44、CD105、CD90、CD73，不表達或是低表達造血干細胞表面抗原[6]。因此，本實驗選擇了幾個常見的標記物，包括：CD73、CD90、CD44、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR。結果顯示，細胞高表達CD44、CD105、CD73和CD90，這與骨髓和其他來源的MSCs表達情況一致[7]。另外，通過誘導劑將其向神經[8]和成骨細胞[9]誘導，提示該細胞具備分化潛能，以上結果說明該細胞符合MSCs的特征[10]。

總之，本研究對hAMSCs原代培養的方法上進行了改進，縮短了培養時間，提高了細胞的得率，為今后其臨床應用提供了保障。

4參考文獻

[1] Taghrid MG，Rabab EH，Amira O，et al．Comparative characteristics of amniotic membrane, endometrium and ovarian derived mesenchymal stem cells: A role for amniotic membrane in stem cell therapy [J]. Middle East Fertility Society Journal， 2014(19):156-170.

[2] Zhang HY, Yang NL. Biological characteristics of placenta-derived mesenchymal stem cells.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, 2010(1):7535-7538.

[3] Kranz A, Wagner DC, Kamprad M, et al. Transplantation of placenta-derived mesenchymal stromal cells upon experimental stroke in rats. Brain Res， 2010(1315):128-136.

[4] 李昆，于艷秋，李世正．兩種分離人胎盤問充質干細胞方法的比較[J]．中國醫科大學學報， 2010(5)：675-676．

[5] Parekkadan B，Milwid JM． Mesenchymal stem cells as therapeutics [J]．Annu Rev Biomed Eng， 2010(12): 87-117．

[6] Sakuragawa N, Kakinuma K, Kikuchi A, et al. Human amnion mesenchyme cells express phenotypes of neuroglial progenitor cells [J]. J Neurosci Res, 2004(2):208-214.

[7] 付蒙，張艷梅，王佃亮，等． 人羊膜間充質干細胞的生物學特性及臨床前研究 [J]. 中國生物工程雜志， 2011(12):115-119.

[8] Sakuragawa N, Kakinuma K, Kikuchi A, et al. Human amnion mesenchyme cells express phenotypes of neuroglial progenitor cells [J]. J Neurosci Res, 2004(2):208-214.

[9] David B. Kamadjaja，Purwati，et al．The Osteogenic Capacity of Human Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cell (hAMSC) and Potential for Application in Maxillofacial Bone Reconstruction in Vitro Study[J]. J Biomedical Science and Engineering， 2014(7):497-503．

[10]樸正福，張海燕，丁淑芹，等．人羊膜間充質干細胞的生物學特性鑒定[J].國際生物醫學工程雜志， 2010(3):157-162．

(2016-02-13收稿，2016-03-27修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

The Improved Culture Method of Human Amnion Mesenchymal Stem Cells

CUI Dongbing, FAN Anran, HE Zhixu

(TheCenterofStemCellandTissueEngineeringResearch,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate and improve the method of human amnion mesenchymal stem cellsseparation and culture (hAMSCs). Methods: The hAMSCs were established with the methods of trypsin, collagenase II, traditional and improved tissue attachment, respectively. The cell morphology and the growth time of hAMSCs were observed, and the immunophenotype were also detected with flow cytometry. In addition, hAMSCs were induced to differentiate into osteoblast and neuroblast with different system and the derived osteoblast and neuroblast were identified then. Results: The hAMSCs obtained with the improved separation method obtain higher purity and can be passaged more times, and the quantity of obtained hAMSCs can be reached up to 3～4 times of enzyme digestion, and 1～2 times of traditional tissue attachment method within the same culture time; furthermore, the obtained hAMSCs highly express CD73, CD90, CD44 and CD105 while did not express CD11b, CD19, CD34, CD45 and HLA-DR; the alizarin staining and neuron-specific enolase detection demonstrated that hAMSCs could be induced into osteoblast and neuroblast. Conclusions: The methods of hAMSCs separation and culture are improved and will provide the basis for the research and application of hAMSC.

[Key words]human amnion mesenchymal stem cells(hAMSCs); cell culture; identification； induce

[中圖分類號]R329.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0414-04

*[基金項目]貴州省科技廳貴州醫科大學聯合基金[黔科合LH字(2014)7078]

**通信作者 E-mail:hzx@gmc.edu.cn

網絡出版時間：2016-04-20網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1844.046.html