提取凈化方法對蔬菜中多菌靈殘留測定影響的研究

潘小紅，劉玉玲，周利平

（1.湖南省食品藥品檢驗研究院，湖南長沙　410001；2.湖南省科技交流交易中心，湖南長沙　410001）

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提取凈化方法對蔬菜中多菌靈殘留測定影響的研究

潘小紅1，劉玉玲1，*周利平2

（1.湖南省食品藥品檢驗研究院，湖南長沙410001；2.湖南省科技交流交易中心，湖南長沙410001）

摘要：采用高效液相色譜法測定多菌靈殘留量，研究了液液萃取、固相萃取（手動）、固相萃取（自動）及快速溶劑-固相萃取4種不同提取凈化方法在不同類別蔬菜中對多菌靈殘留量測定的影響。結果發現，液液萃取的提取效果最低。新鮮蔬菜中，固相萃取（手動）、固相萃取（自動）及快速溶劑-固相萃取效果基本一致；干制蔬菜中，固相萃取的提取效果約為快速溶劑-固相萃取的90%～95%，2種方法準確性及檢出濃度均能滿足GB/T 23380—2009的要求。結果表明，固相萃取（手動）適用于新鮮蔬菜中多菌靈殘留量的測定，干制蔬菜推薦用快速溶劑-固相萃取。該研究簡化了新鮮蔬菜提取凈化步驟，降低多菌靈殘留測定成本，提高了檢測效率。

關鍵詞：多菌靈殘留；蔬菜；固相萃取；快速溶劑萃取

多菌靈（Carbendazim）是一種常用的內吸性廣譜殺菌劑，廣泛應用于農作物防治工作中，其化學性質穩定，對人、畜均有一定毒性，因此有關多菌靈殘留量的分析已經越來越受到重視[1-2]。

目前，國家及地方標準多菌靈殘留測定中樣品前處理的萃取及凈化方法各不相同，《GB/T 20769—2008水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》采用Sep- Pak Vac柱及無水硫酸鈉[3]、《GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌靈殘留的測定高效液相色譜法》的快速溶劑萃取-固相萃取[4]、《NY/T 1453—2007蔬菜及水果中多菌靈等16種農藥殘留測定液相色譜-質譜-質譜聯用法》的固相萃取[5]、《GB/T 5009.188—2003蔬菜、水果中甲基托布津、多菌靈的測定》的液液萃取法[6]。試驗過程中發現，各種方法對不同類別蔬菜中多菌靈殘留量的測定不完全適用，本研究采用高相液相色譜法檢測多菌靈殘留量，對比了液液萃取、固相萃取（手動）、固相萃取（自動）及快速溶劑-固相萃取在不同類別蔬菜中對多菌靈殘留量測定的影響，提高前處理的專屬性。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗原料

干品蔬菜（食用菌香菇、干辣椒）、新鮮蔬菜（蘿卜、生菜、西紅柿）均為超市購買，陽性樣品（四季豆、香菇）為2015年國家餐飲風險監測樣品。

1.1.2儀器與試劑

Ultimate 3000型高效液相色譜儀、DIONEX ASE 350型快速溶劑萃取儀，戴安公司產品；GX- 274型ASPEC全自動固相萃取儀，吉爾森公司產品；TB-215D型電子分析天平，DENVER公司產品。

乙腈、乙酸乙酯、甲醇為色譜純，其余均為分析純；多菌靈標準品，批號為90330，含量為99.5%，德國Dr.Ehrensorfer產品。

1.2試驗方法

1.2.1色譜條件的選擇

色譜柱，Thermo120°A（4.6mm×250mm，5μm）；流動相，流動相V（0.02 mol/L，pH值6.8磷酸鹽緩沖液）+ V（乙腈）= 80+20；流速1.0 mL/min；檢測波長286 nm；柱溫30℃；進樣量20 μL。

1.2.2多菌靈標準溶液的配制

精密稱取多菌靈26.6 mg至100 mL容量瓶中，加甲醇溶至刻度，搖勻，用甲醇稀釋0.053 2～26.6 μg/mL系列標準溶液。

1.2.3提取條件的選擇

（1）液液萃取法。準確稱取粉碎并混合均勻的樣品（新鮮蔬菜25 g，干制蔬菜5 g）于50 mL離心管中，加入甲醇-冰醋酸樣品液（配比為9∶1），振搖30 min，用石油醚振搖2次，每次25 mL，棄去石油醚，45℃水浴中減壓濃縮近干，用5 mL流動相溶解，經0.45 μm濾膜過濾后，供液相色譜測定。

（2）固相萃取（SPE）法。分為全自動固相萃取及手動固相萃取。

準確稱取粉碎并混合均勻的樣品（新鮮蔬菜25 g，干制蔬菜5 g）于50 mL離心管中，加入50 mL甲醇-冰醋酸樣品液（配比為9∶1），振搖30 min，取固相萃取小柱（OasisR MCX，150 mg/6 mL）依次用5 mL甲醇、5 mL超純水進行活化。移取10 mL甲醇-冰醋酸樣品，全部通過固相萃取小柱，棄去流出物。先后用5 mL超純水、5 mL甲醇淋洗，抽干小柱，棄去流出物。再用5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，收集，氮吹儀上濃縮至干，用1 mL流動相溶解，經0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

（3）快速溶劑-固相萃取（ASE）法。準確稱取粉碎并混合均勻的樣品（新鮮蔬菜10 g，干制蔬菜5 g），加入適量硅藻土拌勻，上快速溶劑萃取儀，使用34 mL萃取池，溫度100℃，壓強13.80 MPa，加熱5 min，以甲醇為溶劑靜態萃取5 min，60%溶劑快速沖洗樣品，60 s氮氣吹掃，循環1次，收集全部提取液。45℃水浴中減壓濃縮近干，加10 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液溶解，將上述溶液全部轉移至活化后的固相萃取小柱，活化及萃取過程參照（2）固相萃取法。

1.2.4樣品測定

采用1.2.2固相萃取法和快速溶劑-固相萃取法。

2　結果與分析

2.1回收率分析

從多菌靈的化學結構上看，是一種兩性化合物。在中性和偏堿性水溶液中溶解度低，微溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑，能溶于無機酸和乙酸等。有機酸、堿性條件可增加多菌靈在有機溶劑中的溶解度，因此本試驗固相萃取、液液萃取均采用甲醇冰醋酸為提取劑[7]。

分別在稱好的5 g干品蔬菜（食用菌、干辣椒）、25 g新鮮蔬菜（蘿卜、生菜、西紅柿）添加3.2，14.0，21.2 μg多菌靈進行低、中、高回收率試驗。

不同提取方式各種蔬菜的回收率見表1。

表1　不同提取方式各種蔬菜的回收率/ %

從表1可以看出，液液萃取的回收率介于78.3%～91.8%，固相萃取的回收率介于86.4%～100.2%，快速溶劑-固相萃取回收率介于85.4%～101.4%，固相萃取、快速溶劑-固相萃取回收率低、中、高3個濃度均高于液液萃取，固相萃取（手動）、固相萃取（全自動）、快速溶劑-固相萃取之間回收率無明顯差異。

2.2陽性樣品測定[8]

選用2015年國家餐飲風險監測的2批陽性樣品（香菇、四季豆）進行殘留量的測定。

陽性樣品測定結果見表2。

表2　陽性樣品測定結果/ mg·kg-1

從表2中可以看出，新鮮蔬菜（四季豆）陽性樣品測定中，快速溶劑-固相萃取與固相萃取的結果均大于液液萃取，固相萃取自動與手動結果一致、快速溶劑-固相萃取與固相萃取的結果變化不大；干制蔬菜（香菇）陽性樣品測定中，快速溶劑-固相萃取＞固相萃取＞液液萃取。

表1與表2的數據顯示，樣品加標回收率及陽性樣品的測定，液液萃取效果均明顯低于固相萃取與快速溶劑-固相萃取；加標回收率及新鮮蔬菜的陽性樣品（四季豆）固相萃取與快速溶劑-固相萃取的測定結果基本一致，干制蔬菜陽性樣品（香菇）中固相萃取測定結果低于快速溶劑-固相萃取。推測原因有3個：一是液液萃取是利用多菌靈在酸性甲醇及二氯甲烷中的不同溶解度進行分離，存在提取不夠完全，回收率較低；二是加標回收是用多菌靈標準溶液直接添加至樣品溶液中，陽性樣品中的多菌靈殘留在植物細胞內，因此陽性樣品液液萃取的測定結果比其他3種提取方式的結果低；三是干制蔬菜相對新鮮蔬菜，其植物組織不易破壞，快速萃取儀有利于多菌靈殘留的提取，增加了測定結果。

本研究選擇新鮮蔬菜用固相萃取（手動）、干制蔬菜用快速溶劑-固相萃取測定多菌靈殘留。

2.3樣品測定及方法學考察

2.3.1線性方程考察

多菌靈標準色譜圖及標準曲線見圖1。

圖1　多菌靈標準色譜圖及標準曲線

結果表明，該方法在0.053 2～26.6 μg/mL范圍內呈線性關系，其回歸方程為Y=0.373 5X+0.461 7，R2=0.999 3。

2.3.2重現性考察

分別取新鮮蔬菜（四季豆）及干制蔬菜（香菇）各6份，采用固相萃取（手動）及快速溶劑-固相萃取測定。

固相萃取（手動）及快速溶劑-固相萃取方法重現性試驗見表3。

表3　固相萃取（手動）及快速溶劑-固相萃取方法重現性試驗

從表3中可以看出，采用固相萃取（手動）前處理的新鮮蔬菜（四季豆）及快速溶劑-固相萃取的干制蔬菜（香菇）重現性均較好，RSD分別為2.8%和2.5%。

多菌靈及四季豆陽性樣品色譜見圖2。

圖2　多菌靈及四季豆陽性樣品色譜

2.3.3檢出限及定量限

本方法的檢出限為0.105 ng，定量下限為0.309 ng。取5 g樣品測定時，檢出濃度為0.004 2 mg/kg，最低定量濃度為0.006 1 mg/kg，能夠滿足《GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌靈殘留的測定高效液相色譜法》0.02 mg/kg的要求。

3　結論與討論

本研究對比了液液萃取、固相萃取（手動）、固相萃取（自動）及快速溶劑-固相萃取4種不同前處理方式在不同類別蔬菜中對多菌靈殘留量測定的影響，結果發現液液萃取效果最低，固相萃取（手動）與固相萃取（自動）效果相同；新鮮蔬菜中，固相萃取與快速溶劑-固相均可；干制蔬菜中，固相萃取的提取效果約為快速溶劑-固相萃取的90%～95%。固相萃取（手動）、快速溶劑-固相萃取均具有良好的重現性，能夠滿足《GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌靈殘留的測定高效液相色譜法》的要求。

快速溶劑-固相萃取對輔助儀器的要求比較多，加速溶劑萃取儀（ASE）、固相萃取儀（SPE）購買及維護成本較高，在不少農藥殘留檢測實驗室中都沒有配備，建議新鮮蔬菜中多菌靈殘留量的測定采取固相萃取（手動）前處理方式，所用儀器、化學試劑都可獲得，且成本低，可以準確測定新鮮蔬菜中多菌靈的殘留量。

參考文獻：

［1］吳劍威，金鉞，楊美華，等.多菌靈分析方法研究進展及其在中藥材中的應用［J］.中藥材，2007，30（3）：363-367.

［2］郝金芝.高效液相色譜法測定水果中的多菌靈［J］.中國衛生檢驗雜志，2004，14（5）：586-587.

［3］中華人民共和國秦皇島出入境檢驗檢疫局. GB/T 20769—2008水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法［S］.北京：中國標準出版社，2009.

［4］國家農副產品食品質量監督檢驗中心. GB/T 23380—2009水果、蔬菜中多菌靈殘留的測定高效液相色譜法［S］.北京：中國農業出版社，2009.

［5］農業部熱帶農產品質量監督檢驗測試中心. NY/T 1453—2007蔬菜及水果中多菌靈等16種農藥殘留測定液相色譜-質譜-質譜聯用法［S］.北京：中國農業出版社，2008.

［6］衛生部食品衛生監督檢驗所. GB/T 5009.188—2003蔬菜、水果中甲基托布津、多菌靈的測定［S］.北京：中國標準出版社，2004.

［7］楊秀敏，陳永艷，胡彥學.固相微萃取-高效液相色譜-熒光檢測法分析蘋果汁中的多菌靈和噻菌靈［J］.中國食品學報，2007（7）：122-126.

［8］高國文，朱紅霞.液相色譜法測定香菇中多菌靈農藥殘留方法研究［J］.農藥科學與管理，2010，31（9）：36-38.

Study on the Effect of Extraction and Purification Method on the Determination of Carbendazim Residue in Vegetables

PAN Xiaohong1，LIU Yuling2，*ZHOU Liping2
（1. Hu'nan Provincial Food and Dung Inspction and Research Institute，Changsha，Hu'nan 410001，China；2. Hu'nan Science and Technology Exchange Center，Changsha，Hu'nan 410001，China）

Abstract：With high performance liquid phase chromatography determination of carbendazim residue，effects of four different extraction and purification methods of liquid- liquid extraction，SPE（manual），SPE（automatic）and FSE- SPE extraction are studied. Found that liquid- liquid extraction has lowest effect，SPE（manual & automatic），and FSE- SPE had the same effect in fresh vegetables，SPE（manual & automatic）is about 95%～90% of FSE in dry vegetables，and accuracy of these two methods are can meet the requirements of GB/T 23380—2009. The results show that SPE（manual）is applicable for the determination of carbendazim residues in fresh vegetables and FSE- SPE extraction is recommended to dry vegetables. This study simplifies the extract purification step，cut cost and improve the detection efficiency on the determination of carbendazim residue in fresh vegetables.

Key words：carbendazim residue；vegetables；solid phase extraction（SPE）；fast solvent extraction（FSE）

作者簡介：潘小紅（1983—），女，碩士，助理研究員，研究方向為食品與保健食品及化妝品的檢驗和研發。*通訊作者：周利平（1965—），女，博士，副研究員，研究方向為科技成果推廣、產業技術轉移和科技金融。

收稿日期：2016- 01- 22

文章編號：1671- 9646（2016）03b- 0054- 04

中圖分類號：TS255.7

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.042