Tae-miR9677小串聯模擬靶標(STTM)表達載體構建及小麥的遺傳轉化研究

李趙杰，簡 超，劉香利，趙惠賢

(西北農林科技大學生命科學學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊陵 712100)

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Tae-miR9677小串聯模擬靶標(STTM)表達載體構建及小麥的遺傳轉化研究

李趙杰，簡 超，劉香利，趙惠賢

(西北農林科技大學生命科學學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊陵 712100)

摘要：小串聯模擬靶標(Short tandem target mimic,STTM)技術是一種新開發的miRNA功能研究方法。 Tae-miR9677作為一種新發現的在小麥穗部特異性高表達的miRNA，其功能至今未知。為了進一步探索 Tae-miR9677的功能，構建了Ubiqutin(UBI)啟動子啟動的 Tae-miR9677 STTM過表達載體，并通過基因槍介導法對小麥品種綿陽19幼胚愈傷組織進行轉化。結果表明，3 683個愈傷組織經過PPT(Phosphinothricin)篩選，最終分化獲得42株再生植株；利用特異性引物進行PCR檢測，鑒定出8株T0代陽性植株。

關鍵詞：Tae-miR9677；小串聯模擬靶標(STTM)；小麥；載體構建；轉基因

目前，大量研究發現，miRNA在植物的生長、發育和逆境脅迫應答等各種生物學過程中發揮重要的調節作用。小麥中已鑒定出大量miRNA，對這些miRNA的功能進行研究，將對小麥遺傳育種改良有重大的生物學意義[1]。

通過抑制目的基因的表達來進行植物基因功能研究是功能基因研究重要策略之一。近年來，miRNA模擬靶標(Target mimicry，TM)的發現揭示了一種全新的miRNA沉默調控機制，并在miRNA功能研究中得到廣泛應用[2-3]。Yan等[4]在miRNA 模擬靶標的基礎上，創新出一種更加高效的沉默miRNA的新方法-小串聯模擬靶標(Short tandem target mimic,STTM)。STTM由2個TM和一段48 nt起連接作用的特定序列組成，2個TM在其miRNA切割位點處都額外增加3個堿基，形成一個凸起結構，這一結構使其可以結合miRNA但不會被其切割。與傳統TM技術構建的突變體相比，STTM突變體的表型更加明顯，對miRNA的抑制效果更加顯著[4]。利用過表達STTM轉基因植株研究miRNA功能，已在擬南芥[5]、水稻[6]和陸地棉[7]等多種植物中得以實現，但在小麥中尚未見報道。

本實驗室韓 冉等[8]通過對小麥品種小偃16的幼苗、旗葉和花后5、10及20 d籽粒的sRNA庫進行深度測序，發掘出55個新的miRNA并提交至miRbase數據庫。本研究在此研究的基礎上，以在小麥穗部特異性高表達的 Tae-miR9677為研究對象，人工合成 Tae-miR9677的小串聯模擬靶標序列，并將其構建到植物表達載體pCAMBIA3301上，采用基因槍轉化法將該表達載體轉入小麥中，旨在獲得轉基因小麥株系，用以探索利用miRNA小串聯模擬靶標技術研究小麥miRNA功能的可行性。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1植物材料

轉基因小麥受體綿陽19播種于西北農林科技大學農作一站試驗田，于花后12～14 d采幼胚培養。

1.1.2載體與試劑

載體pCAMBIA3301和pTCK303(含UBI啟動子)均由本實驗室保存；pMD19-T載體、pUC57載體、TaqDNA聚合酶、質粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒、TOP10感受態細胞、限制性內切酶HindⅢ、BamHⅠ和KpnⅠ等購自大連寶生物工程有限公司；限制性內切酶PmlⅠ購自NEB公司；DNA markers Ⅲ、DNA markers 2000 plus購自康為世紀生物科技有限公司；引物均由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.1.3培養基

誘導培養基：MS培養基+500 mg·L-1酸水解酪蛋白+2.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂

高滲培養基：MS培養基+500 mg·L-1酸水解酪蛋白+2.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.4 mol·L-1甘露醇分化篩選培養基：MS培養基+1 mg·L-1KT+500 mg·L-1酸水解酪蛋白+2.0 mg·L-1PPT+30 g·L-1蔗糖

生根培養基：1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA+15 g·L-1蔗糖+5.5 g·L-1瓊脂

1.2 Tae-miR9677 STTM表達載體的構建

本研究設計的 Tae-miR9677 STTM序列由上海生工生物工程股份有限公司合成后，在該序列兩端加上BamHⅠ、PmlⅠ和KpnⅠ限制性內切酶的酶切位點，然后將其連接到載體pUC57上。以載體質粒pTCK303為模板，用特異性引物UBI-F/UBI-R(UBI-F：5′-CTGCAGTGCAGC GTGACCC-3′; UBI-R:5′-CTGCAGAAGTAAC ACCAAAC-3′)進行擴增反應，獲得UBI啟動子片段，并通過TA克隆將其連接至載體pMD19-T上，獲得重組載體pMD19-T-1。隨后以含有 Tae-miR9677 STTM序列的載體pUC57為模板，用特異性引物STTM9677-F/STTM 9677-R(5′-GTTGTGTGGAATGTATGGAGC-3′; 5′-GCT GTAATCACACTGGCTCA-3′)擴增得到含有BamHⅠ、PmlⅠ和KpnⅠ三個酶切位點的目的片段 Tae-miR9677 STTM，用限制性內切酶BamHⅠ和KpnⅠ同時雙酶切pMD19-T-1和擴增得到的目的片段 Tae-miR9677 STTM，用T4連接酶將酶切得到的目的片段 Tae-miR9677 STTM連接至酶切后的pMD19-T-1上，獲得含有UBI啟動子和目的序列 Tae-miR9677 STTM的中間載體pMD19-T-2。對pMD19-T-2進行測序，確定UBI與目的序列連接正確無誤后，用限制性內切酶HindⅢ和PmlⅠ對pMD19-T-2和植物表達載體pCAMBIA3301進行雙酶切，用UBI啟動子+ Tae-miR9677 STTM片段替換掉表達載體pCAMBIA3301上的 CAMV35S啟動子和GUS基因，以獲得最終的轉化載體pCAMBIA3301-STTM 9677。選取陽性克隆的重組質粒進行HindⅢ和PmlⅠ的雙酶切檢測，并進行測序，以鑒定構建的轉基因表達載體的正確性。

1.3基因槍轉化

小麥基因槍轉化參照已報道的方法[9-11]。采集花后12～14 d的綿陽19未成熟種子，選取飽滿的籽粒用70%乙醇表面消毒5 min，再用0.1%的升汞消毒15 min，無菌水沖洗5次。種子消毒后，取幼胚，盾片向上接種于誘導培養基中，置于24 ℃暗培養10 d，將幼胚的愈傷組織集中于高滲培養基的培養皿中央直徑3 cm的范圍內，高滲處理6 h后用BIO-RAD公司的PDS-1000/He基因槍進行轟擊，金粉用量40 μg·槍-1，質粒pCAMBIA3301-STTM 9677用量1 μg·槍-1，氦氣壓力1 100 psi，轟擊距離9 cm。轟擊后的愈傷組織在高滲培養基上處理16 h后，將愈傷組織轉移到誘導培養基，24 ℃暗培養1周?；謴团囵B后的愈傷組織轉移到分化篩選培養基中，24～26 ℃光照培養10～12周，待愈傷組織分化小苗生長至苗高3～4 cm后轉移到生根培養基中，待小苗根系發育充分后，移至4 ℃冰箱春化5周，將春化后的小苗移栽到花盆，在可控溫室中培養。

1.4轉基因小麥檢測

待可控溫室中生長的小麥苗長至三葉期，每株取1片葉，采用CTAB法提取基因組DNA。目的序列PCR檢測所用引物9677STTM-F/9677STTM-R(9677STTM-F:5′-CAGGCTTTA CACTTTATGCTTCC-3′;9677STTM-R:5′-TGATAATCATCGCAAGACC-3′)是根據UBI啟動子、 Tae-miRNA9677 STTM序列和兩端酶切位點序列設計，預期擴增產物片段約2 164 bp。擴增體系總體積為20 μL，包含2×EsTaqMasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL(約700 ng)和ddH2O 7 μL。擴增程序： 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物經 1%瓊脂糖EB凝膠電泳，紫外拍照。

2結果與分析

2.1表達載體的構建

按照方法1.2中描述的策略進行 Tae-miR9677 STTM表達載體的構建。構建過程中對每種重組質粒均進行菌落PCR檢測或酶切鑒定。圖1為利用pMD19-T通用引物對方法中介紹的重組質粒pMD19-T-2進行菌落PCR檢測的結果。由圖1可以看出，1～4泳道檢測到的為UBI啟動子+目的序列，片段大小為2 164 bp，與預期大小相符，表明其為連接成功的單克??；而5泳道檢測到的擴增片段，大小只有1 993 bp，比預期的小，說明其為未連接成功質粒。對重組質粒pCAMBIA3301-STTM 9677進行雙酶切鑒定，鑒定結果如圖2所示。圖2中1泳道為HindⅢ單酶切質粒結果，2泳道為HindⅢ與PmlⅠ雙酶切結果，雙酶切后得到的大小兩個片段，大片段為載體骨架，小片段為2 164 bp的目的片段，這表明目的片段已成功連接至pCAMBIA3301載體上。進一步將得到陽性克隆送樣測序，測序結果正確，表明 Tae-miR9677 STTM表達載體pCAMBIA3301-STTM 9677構建成功，可用于下一步基因槍轉化實驗。

M：DNA marker Ⅲ；1～4：陽性單克??；5：陰性單克隆

M:DNA markerⅢ; 1-4:Positive clones; 5:Negative clone

圖1重組中間載體pMD19-T-2菌落PCR檢測結果

Fig.1Colony-PCR detection of middle vector pMD19-T-2

M：DNA markerⅢ；1：重組載體HindⅢ單酶切檢測；2：重組載體HindⅢ+PmlⅠ雙酶切檢測

M:DNA markerⅢ; 1:HindⅢ single enzyme detection of recombinant vector; 2:HindⅢ+PmlⅠdouble enzyme detection of recombinant vector

圖2重組載體酶切檢測結果

Fig.2Enzyme detection of recombinant vector

2.2轉基因植株的獲得

接種小麥綿陽19幼胚4 000個，在誘導培養基培養10 d后，獲得愈傷組織3 683個，愈傷誘導率為92.07%。以獲得的愈傷組織為受體材料，用pCAMBIA3301-STTM 9677質粒基因槍轉化，經過PPT篩選和誘導分化，共獲得再生植株47株，其各階段培養生長狀況如圖3所示，移栽至溫室中存活42株。

2.3轉基因植株的PCR檢測

A:誘導的幼胚愈傷組織；B:篩選分化；C:再生苗；D:移栽至花盆的再生苗

A:Callus induced from immature embryo; B:Resistance selection and differentiation; C:Regenerated transgenic plants:D:Transgenic plants grown in pot

圖3綿陽19轉 Tae-miR9677 STTM的再生植株

Fig.3 Transgenic plants of Mianyang 19 with Tae-miR9677 STTM

將獲得的轉基因再生植株移栽至培養缽中于溫室培養，取其幼嫩葉片提取基因組DNA，按順序編號為1～42，并根據目的序列設計特異引物進行PCR檢測。經多次PCR檢測發現，陰性對照(非轉基因的綿陽19植株)和空白對照(ddH2O)均沒有擴增產物，陽性植株與質粒的擴增產物大小一致，均為2 164 bp大小的目的片段(圖4)。42株再生植株中共有8株為轉基因陽性植株，轉化率為0.21%(圖4)。

M：DNA marker III；7、13、26、28、32、35、38和42：轉基因陽性植株；Y：陰性對照；S：ddH2O；Z：質粒

M:DNA marker III; 7,13,26,28,32,35,38 and 42:Positive transgenic plants; Y:Negative control; S:ddH2O; Z:Plasmid

圖4T0代再生植株特異引物PCR檢測結果

Fig.4PCR assay of regenerated T0plants

3討 論

近年來，miRNA的TM開發為研究miRNA及調控靶標的功能提供了一種有效的方法。該技術是通過miRNA的沉默來揭示一種全新的調控機制[12-20]。Yan等[3]在擬南芥中轉基因過表達 miR165/166-STTM，對 miRNA165/166家族的功能進行有效抑制，結果發現，該轉基因突變體植株矮小、彎曲、葉片不規則；并且通過與傳統轉 miR165/166-TM的突變體相比，轉 miRNA165/166-STTM突變體的表型更加明顯。2014年，Gu等[6]將 miRNA165/166-STTM導入陸地棉，導致 miRNA165/166的靶標mRNAs顯著增多，從而導致轉基因棉花葉片折皺并向下彎曲，說明 miRNA165/166-STTM有效沉默了 miRNA165/166，解除了 miRNA165/166對其靶標的抑制。方瑞秋等[5]在水稻中通過農桿菌轉化法獲得轉STTM 1428e-3p/1428a-3p-1的轉基因水稻，觀察發現其有效分蘗數減少，谷穗變大，花粉育性及結實率下降等一系列現象，初步揭示了 miR1428e-3p/1428a-3p-1的生物學作用。

小麥作為重要的糧食作物，揭示其生長發育過程中miRNA的調控作用十分重要。但是，目前小麥miRNA的研究工作大多還停留在miRNA的鑒定和發掘上[21-23]。關于miRNA功能的研究鮮有報道，其主要原因可能是缺乏有效的小麥miRNA功能研究方法。上述在其他物種中建立的通過轉miRNA-STTM的技術來研究目標miRNA功能的方法為小麥miRNA功能研究提供了借鑒。據此，本研究以本實驗室前期研究發現的小麥穗部特異性高表達 Tae-miRNA 9677為研究對象，利用基因槍轉化法，將以UBI啟動子啟動的 Tae-miR9677 STTM序列導入小麥品種綿陽19之中；對獲得的42個再生植株經過多次重復目標序列特異PCR鑒定，獲得了8個轉基因T0代陽性植株。這幾個植株已經開花結實，有待收獲。但是，目標序列是否插入并整合進受體小麥基因組上，還有待對此轉基因植株后代進行追蹤檢測。如果后代植株中確有目標序列整合進基因組中，并能穩定表達的轉基因陽性株系，這些陽性株系后續將可用于分析其中 Tae-miR9677及其調控靶標的水平變化，揭示 Tae-miR9677的功能研究。

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Construction of Expression Vector of Tae-miR9677 Short Tandem Target Mimic (STTM) and Transformation in Wheat

LI Zhaojie,JIAN Chao,LIU Xiangli,ZHAO Huixian

(College of Life Science,Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:Short tandem target mimic (STTM) is an important method for miRNA function research. Tae-miR9677 is a newly discovered miRNA with high expression level in wheat spike,and its function has not been revealed. Therefore,it is very important to explore the function of Tae-miR9677 using STTM technology. In this investigation,the plant expression vector of Tae-miR9677 STTM controlled under Ubiqutin promoter was constructed. Then,3 683 immature embryos of Mianyang 19 were transformed using this vector by biolistic particle. After phosphinothricin selection and regeneration,42 regenerated plants were obtained,and of which eight were identified to be positive transgenic plants with Bar and Tae-miR9677 genes by PCR analysis.

Key words:Tae-miR9677; Short tandem target mimic (STTM);Wheat;Construction of expression vector;Transformation

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)04-0404-05

通訊作者：趙惠賢(E-mail:hxzhao212@nwsuaf.edu.cn)

基金項目：國家自然科學基金項目(31471482，31101205)

收稿日期：2015-12-11修回日期：2016-02-15

網絡出版時間：2016-04-01

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160401.1529.004.html

第一作者E-mail：zhaojieli1991@163.com