扁杏仁肽對血管內皮功能的影響

史　婷，郝雙利，張志琪

(藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西師范大學化學化工學院，西安　710062)

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扁杏仁肽對血管內皮功能的影響

史婷，郝雙利，張志琪*

(藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西師范大學化學化工學院，西安710062)

摘要：目的探究扁杏仁肽對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells， HUVECs)內皮功能的影響。方法體外培養HUVECs，以150，300和600 μg·mL-1不同劑量的扁杏仁全肽、扁杏仁谷蛋白肽給藥，進行細胞生長增殖試驗及細胞培養液中一氧化氮(NO)和內皮素(ET)含量的檢測。結果細胞培養48 h后，與對照組相比，所有劑量的扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽對HUVECs均有顯著的抑制作用(P<0.01)，同時顯著地減弱去甲腎上腺素對細胞增殖的促進作用(P<0.01)；在不同劑量扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽干預下培養細胞48 h，與對照組相比，培養液中NO含量顯著升高、ET含量顯著降低(P<0.01)，同時對去甲腎上腺素具有顯著的拮抗作用(P<0.01)。結論扁杏仁全肽特別是扁杏仁谷蛋白肽對血管內皮功能具有很強的保護作用。

關鍵詞：扁杏仁全肽；扁杏仁谷蛋白肽；人臍靜脈內皮細胞；內皮素；一氧化氮

血管內皮細胞是位于血管內表面的單層細胞，覆蓋于整個血管系統的內表面[1]，它不僅為血液流動提供光滑的表面，還可調節血管張力，血管內皮功能障礙是高血壓發生、發展的病理基礎[2]。高血壓患者因內皮細胞功能受損，導致一氧化氮(NO)釋放減少，內皮素(ET)釋放量增加[3-4]。已有報道，扁杏仁肽具有血管緊張素轉移酶(ACE)抑制作用[5-6]，本研究采用扁杏仁肽對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)作用，通過細胞增殖和測定釋放一氧化氮(NO)、內皮素(ET)量，探討其對血管內皮功能的影響，以期為扁杏仁降壓肽藥物的開發提供實驗依據。

1儀器與試藥

1.1儀器C-W10XB/22型倒置光學顯微鏡，1.0 R高速臺式冷凍離心機(日本Nikon公司)；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(蘇州凈化科技有限公司)；二氧化碳培養箱(Thermo公司)；細胞計數板(上海求精生化試劑儀器有限公司)；URIT-660型酶聯免疫分析儀(大連優利特科技發展有限公司)。1.2試藥扁杏仁全肽(以陜北扁杏仁為原料，提取蛋白，經復合蛋白酶Protamex和堿性內切酶Alcalase雙酶水解獲得)；扁杏仁谷蛋白肽(以扁杏仁谷蛋白為原料，經堿性內切酶Alcalase酶解、超濾過1K膜、凍干獲得，經鑒定其對ACE 的IC50=96.03 μg·mL-1)；人臍靜脈內皮細胞(西安交通大學醫學院惠贈)。高糖DMEM(美國Gibco公司)；胎牛血清(蘭州民海生物技術研究所)；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮(MTT，美國Sigma公司)；胰蛋白酶(美國Amresco公司)；卡托普利(Cap)和去甲腎上腺素(NE)購于中國食品藥品鑒定所；一氧化氮(NO)試劑盒(南京建成生物工程研究

所)；內皮素(ET)Elisa試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)。

2實驗方法

2.1HUVECs的培養按一般細胞培養方法接種、培養，培養液為高糖DMEM+20%胎牛血清，隔天更換培養液，待細胞生長融合長至覆蓋瓶底80%～90%時，用胰酶消化法對細胞按1∶2的比例進行傳代。

2.2實驗分組及處理取對數生長期HUVECs，用PBS沖洗后，胰酶消化，制成 1×104個·mL-1或1×105個·mL-1細胞懸液，隨機分為11組。(1)空白對照組：不加任何干預因素；(2)～(11)組為實驗組，其中(2)～(4)為扁杏仁全肽實驗組：低、中、高劑量扁杏仁全肽質量濃度分別為150，300和600 μg·mL-1；(5)～(7)為扁杏仁谷蛋白肽實驗組：低、中、高劑量扁杏仁谷蛋白肽質量濃度分別為150，300和600 μg·mL-1；(8)為卡托普利陽性對照組(Cap組)：Cap濃度為10-5mol·L-1；(9)為去甲腎上腺素組(NE組)：NE質量濃度為100 μg·mL-1；(10)為扁杏仁全肽+NE組：扁杏仁全肽與NE質量濃度分別為300和100 μg·mL-1；(11)為扁杏仁谷蛋白肽+NE組：扁杏仁谷蛋白肽與NE質量濃度分別為300和100 μg·mL-1。

2.3MTT比色法測定細胞增殖將1×104個·mL-1細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板，在37 ℃、體積分數為5%的CO2培養箱中靜置培養。待細胞貼壁后，空白對照組加入100 μL高糖DMEM培養液；實驗組(2)～(11)按分組要求分別加入同體積的不同干預因素。每組設6個復孔，分別繼續培養24，48和72 h。培養結束后，每孔加入10 μL MTT溶液，繼續孵育4 h，終止培養，吸棄培養液。每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物質充分溶解，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其吸光度(A)值，計算細胞增殖率。

細胞增殖率=實驗組A值/空白對照組A值×100%

2.4NO和ET含量測定將1×105個·mL-1細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板培養，待細胞貼壁后，按分組要求分別加入不同干預因素，分別繼續培養10，24和48 h，收集培養上清液，按試劑盒說明書測定NO和ET含量。

3實驗結果

3.1扁杏仁肽對細胞增殖的影響在倒置相差顯微鏡下觀察，空白對照組HUVECs接種后 6 h內，細胞基本伸展貼壁，呈現單層扁平狀；12 h后HUVECs生長旺盛，多角形細胞顯單層、鋪路石狀鑲嵌排列，核分裂相多見，1～2個核仁，胞漿豐富；72 h后細胞融合達85%左右。用MTT染色后測定的細胞增殖率如表1所示。

表1扁杏仁肽對HUVECs相對增殖率(%)的影響

Tab. 1 Influence of almond peptide on the relative growth rate(%) of HUVECs

±s，n=6)

注：與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與NE組比較△△P<0.01。

由表1可見，與空白對照組比較，細胞培養24 h后，除低劑量扁杏仁全肽的抑制生長作用不顯著、中劑量扁杏仁全肽和低劑量扁杏仁谷蛋白肽抑制生長作用顯著(P<0.05)外，卡托普利及其他劑量的扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽對HUVECs均有極顯著的抑制生長作用(P<0.01)；當細胞培養時間達48 h時，卡托普利及所有劑量的扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽均對HUVECs有極顯著的抑制作用(P<0.01)；去甲腎上腺素(NE組)可極顯著地促進HUVECs生長，但與中劑量扁杏仁全肽或扁杏仁谷蛋白肽同時作用時，作用極顯著地減弱(P<0.01)。

3.2扁杏仁肽對一氧化氮(NO)和內皮素(ET)含量的影響見表2。

表2扁杏仁肽對HUVECs培養液中NO含量(μmol·mL-1)的影響

Tab.2 Influence of almond peptide on the releasing NO of HUVECs

±s，n=6)

注：與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與NE組比較△P<0.05，△△P<0.01。

與空白對照組比較，卡托普利及不同劑量的扁杏仁全肽、扁杏仁谷蛋白肽均可升高HUVECs培養液中NO含量、顯著降低ET含量(P<0.01)，培養時間越長，作用越強；卡托普利和扁杏仁谷蛋白肽的作用明顯強于扁杏仁全肽，見表2～3。

表3扁杏仁肽對HUVECs培養液中ET含量(pg·mL-1)的影響

Tab.3 Influence of almond peptide on the releasing ET of HUVECs

±s，n=6)

注：與空白對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與NE組比較△P<0.05，△△P<0.01。

實驗結果顯示，去甲腎上腺素(NE組)可極顯著地降低HUVECs培養液中NO含量，促進ET分泌；中劑量扁杏仁全肽或扁杏仁谷蛋白肽對去甲腎上腺素具有顯著的拮抗作用，中劑量扁杏仁谷蛋白肽與去甲腎上腺素合用，可使培養液中NO含量和ET值接近空白對照(P>0.05)。

4討論

血管內皮細胞的重要功能之一是分泌血管舒縮活性物質，并借此來調節血管張力及血流量[7]。其中NO 是目前所知的最重要內皮舒張因子[2]；ET是內皮血管收縮因子，具有強大的血管收縮功能[8]。作為維持血管舒縮功能的重要活性物質，ET 和 NO 在正常情況下處于動態平衡[9]。內皮細胞損傷后，釋放的很多活性物質如凝血酶、腺苷二磷酸、三磷酸腺苷、5-羥色胺等，破壞了自身調節體系平衡，使得 ET合成增多、 NO的合成和釋放減少，導致血管張力調節紊亂，內皮依賴性舒張功能下降， 血管壁結構改變，導致血壓升高[10]。本實驗研究中，扁杏仁肽對HUVECs具有極顯著地抑制生長作用，能夠促進HUVECs分泌NO，減少ET分泌；同時，扁杏仁肽可減輕去甲腎上腺素(NE)引起的內皮細胞增殖，對去甲腎上腺素抑制NO分泌、促進ET分泌具有顯著地拮抗作用。這些研究結果表明，扁杏仁肽對血管內皮功能具有保護作用，且具有與血管緊張素轉化酶抑制劑類藥物卡托普利相似的降壓機制。這為扁杏仁肽特別是扁杏仁谷蛋白肽降壓藥物的開發和利用提供了參考依據。

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The protective effect of peptides derived from sweet almond on endothelial function

SHI Ting，HAO Shuangli，ZHANG Zhiqi*

(Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry，School of Chemistry and Chemical Engineering，Shaanxi Normal University，Xi′an 710062， China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of sweet almond peptides on the endothelial function of human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs). MethodsHUVECs were treated with different doses of the almond wholly peptides and the almond glutelin peptides (150，300 and 600 μg·mL-1)， and then the growth experiment of cells was carried out and the amount of NO and ET in culture media were measured.ResultsAlmond wholly peptides and the almond glutelin peptides could significantly inhibit the HUVEC growth， promote the NO releasing and reduce the ET level(P<0.01)，and significantly antagonize the effect of noradrenalin.ConclusionThe sweet almond peptides， especially the almond glutelin peptides， have strong protective action on the endothelial function of HUVECs.

Key words:sweet almond wholly peptides；almond glutelin peptides；human umbilical vein endothelium cells；endothelin；nitric oxide

(收稿日期：2015-10-14)

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1004-2407(2016)03-0267-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.014

*通信作者：張志琪，男，教授，博士生導師

作者簡介：史婷，女，碩士研究生

基金項目：陜西省農業攻關項目(編號：2008K01-23)