甘丙肽及其受體亞型在人乳腺癌標本中的表達

張　帥　鄧佳卉　徐志卿　戚曉東*

(1.安徽醫科大學北京軍區總醫院臨床學院乳腺科，北京100700；2.首都醫科大學三博腦科醫院功能神經外科，北京 100093；3. 首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系，北京 100069)

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甘丙肽及其受體亞型在人乳腺癌標本中的表達

張帥1鄧佳卉2徐志卿3戚曉東1*

(1.安徽醫科大學北京軍區總醫院臨床學院乳腺科，北京100700；2.首都醫科大學三博腦科醫院功能神經外科，北京 100093；3. 首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系，北京 100069)

【摘要】目的 探索甘丙肽(galanin，GAL)及其受體亞型(galanin receptor1、2、3， GALR1、2、3)在乳腺癌及癌周組織中的表達情況，分析其與不同臨床治療方法的關系。方法qRT-PCR法檢測乳腺癌及癌周組織的GAL及其3種受體亞型mRNA的表達情況。Western blotting分析GAL在乳腺癌及癌周組織中的表達情況。t檢驗分析不同術前處理組之間癌組織的GAL及其受體亞型表達的變化，而配對t檢驗用于分析同一術前處理組內癌組織和癌周組織之間GAL及其受體亞型表達的變化。結果在術前無治療組中，癌組織GAL mRNA及GAL蛋白比癌旁組織高(P<0.05，P<0.01)，而GALR1、GALR2、GALR3 mRNA比癌旁組織低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。經過新輔助化學治療(neoadjuvant chemotherapy, NAC)與高強度聚焦超聲射頻消融術(high intensity focused ultrasound, HIFU)治療后，癌組織與癌旁組織相比，GAL及其受體mRNA和蛋白差異無統計學意義，但是與術前無治療組癌組織相比，GAL mRNA及GAL蛋白明顯降低(P<0.05)。此外，經過NAC治療后癌組織中GALR3 mRNA要明顯高于術前無治療組的癌組織(P<0.01)。結論GAL及其受體亞型在乳腺癌中存在異常表達，并與臨床治療方法有關，可能為乳腺癌的診斷、治療及預后提供了新的生物學標志。

【關鍵詞】乳腺癌；甘丙肽；甘丙肽受體亞型

乳腺癌是國內外女性最常見的惡性腫瘤之一，且其發病率仍呈上升趨勢[1-2]。乳腺癌的綜合治療方案制定目前主要依據雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)、人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2, Her-2)、細胞增生核抗原(cell proliferation associated nuclear antigen, Ki-67)等分子標志物的檢測。其中針對Her-2這一靶點而開發的曲妥珠單抗在臨床的應用開啟了乳腺癌的靶向治療時代[3]，但是針對三陰性乳腺癌和其他難治性乳腺癌，仍沒有理想的治療靶點和特異性藥物，相關藥物靶點的尋找和特異性藥物的開發仍然是目前研究的熱點之一。

甘丙肽(galanin，GAL)是一種由30個氨基酸殘基構成的神經肽，已知的3種受體亞型(galanin receptor1、2、3，GALR1、2、3)均為G蛋白偶聯型受體[4]。除在神經系統中廣泛表達外，研究[5-6]顯示GAL及其受體亞型在多種腫瘤中均有表達，且在診斷、治療、預后和細胞生物學特性等方面扮演著重要的角色。然而，目前國內外針對GAL及其受體亞型與乳腺腫瘤的關系的研究僅有少量報道[7-8]，在乳腺腫瘤及瘤周組織中的表達情況及與臨床資料的關系尚未明確。本研究即對其在乳腺癌及癌周組織中的表達情況進行了檢測，分析與不同臨床治療方法之間的關系。

1材料與方法

1.1臨床標本

選取2015年2月至2015年10月于北京軍區總醫院乳腺中心術前經穿刺病理確診為乳腺癌并行手術患者19例(表1)。均于術中切取腫瘤及瘤周乳腺組織標本，所取標本立即使用干冰凍存。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2主要試劑

RNA提取試劑盒(Qiagen公司，德國)；熒光定量PCR試劑盒(ABI公司，美國)；反轉錄試劑盒(Invitrogen公司，美國)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司，美國)，甘內肽小鼠抗人單克隆抗體(Sigma公司，美國)，β-actin小鼠抗人單克隆抗體(Sigma公司，美國)，HRP二抗(Amersham公司，美國)，Western blotting相關試劑(普利萊基因技術有限公司，中國)。

表1　乳腺癌患者信息

ER:estrogen receptor; PR:progesterone receptor; Her-2:human epidermal growth factor receptor-2; Ki-67:cell proliferation associated nuclear antigen; HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy.

1.3主要方法

1.3.1實時熒光定量PCR檢測GAL及其受體GALR1、GALR2和GALR3 mRNA的量

按照Qiagen公司RNA提取試劑盒操作說明提取制備總RNA，應用反轉錄試劑盒合成cDNA。設計并驗證人GAL及其受體引物(表2)，引物均由Invitrogen公司合成。GAL及其受體GALR1、GALR2和GALR3表達用相對定量PCR的SYBR Green法檢測，每例重復3次實驗。以術前無治療組的癌周組織mRNA的相對變化的倍數作為100%參照。

表2　甘丙肽及其受體引物

1.3.2蛋白質提取和Western blotting法檢測GAL蛋白表達量

提取乳腺組織總蛋白，經BCA法定量，調整樣本為相同蛋白濃度，取10 μL相同總量蛋白上樣，經SDA-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜上，鼠抗人GAL (1∶100稀釋)，內參GAPDH (1∶5 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗1 h，顯影曝光并采集圖像，通過Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.4統計學方法

2結果

2.1乳腺癌組織中GALmRNA的表達

術前未經治療的乳腺癌組織中GALmRNA表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)，而經過新輔助化學治療(neoadjuvant chemotherapy, NAC)或高強度聚焦超聲射頻消融術(high intensity focused ultrasound, HIFU)治療的乳腺癌組織中GALmRNA表達與癌旁組織相比差異無統計學意義，但是明顯低于未經治療的乳腺癌組織(P<0.05)，詳見圖1。

2.2GAL蛋白在乳腺癌組織中的表達

術前未經治療的乳腺癌組織中GAL蛋白表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.01)，而經過NAC或HIFU治療的乳腺癌組織中GAL蛋白表達與癌旁組織相比差異無統計學意義，但是明顯低于未經治療的乳腺癌組織(P<0.05)，詳見圖2。

2.3乳腺癌組織中GALR1 mRNA的表達

術前未經治療的乳腺癌組織中GALR1 mRNA表達顯著低于癌旁組織(P<0.05)，而經過NAC或HIFU治療的乳腺癌組織中GALR1 mRNA表達與癌旁組織相比差異無統計學意義(圖3)。

圖1　乳腺癌組織中GAL mRNA的表達

*P<0.05;#P<0.05; GAL:galanin; HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

圖2　Western blotting法檢測乳腺癌組織中

**P<0.01;#P<0.05; GAL:galanin;HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

圖3　乳腺癌組織中GALR1 mRNA的表達

*P<0.05; GALR:galanin receptor;HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.4乳腺癌組織中GALR2 mRNA的表達

術前未經治療的乳腺癌組織中GALR2 mRNA表達顯著低于癌旁組織(P<0.05)，而經過NAC或HIFU治療的乳腺癌組織中GALR2 mRNA表達與癌旁組織相比差異無統計學意義(圖4)。

圖4　乳腺癌組織中GALR2 mRNA的表達

*P<0.05; GALR:galanin receptor; HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.5乳腺癌組織中GALR3 mRNA的表達

術前未經治療的乳腺癌組織中GALR3 mRNA表達顯著低于癌旁組織(P<0.01)，而經過NAC或HIFU治療的乳腺癌組織中GALR3 mRNA表達略低于癌旁組織但差異無統計學意義，經過NAC治療后癌組織中GALR3 mRNA要明顯高于術前無治療組的癌組織(P<0.01)，詳見圖5。

3討論

研究[4]顯示多種非神經內分泌腫瘤中都有神經肽及其受體表達。這些肽和受體為腫瘤的診斷、同位素示蹤和具有細胞毒性的肽類似物治療提供了分子學依據。其表達與腫瘤的分化程度及侵襲性相關，其促進或者抑制癌細胞增生活性的作用，有指導治療的價值。

GAL在不同腫瘤中有著不同的表達情況與臨床意義。如Kim等[6]報道結腸腺癌中GAL與GALmRNA要高于癌旁組織，且其表達會隨著腫瘤大小的增長與分期的增加而明顯升高，并與患者預后相關。Sugimoto等[9]報道頭頸部鱗癌中GALmRNA水平是升高的。目前針對GAL及其受體系統與乳腺癌關系的研究很少，Ormandy等[7]報道甘丙肽基因定位于11q13，該位點在乳腺癌中常發生擴增。本研究中，在術前無治療組的癌組織中GAL及GALmRNA水平比癌周組織的要高，其可能與基因擴增有關。

圖5　乳腺癌組織中GALR3 mRNA的表達

**P<0.01;##P<0.01; GALR:galanin receptor; HIFU：high intensity focused ultrasound; NAC：neoadjuvant chemotherapy; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

Chung等[8]在乳腺癌及多種其他癌細胞系中發現GAL受體基因-GALR2基因啟動子存在過度甲基化的現象，這部分解釋了GALR2的mRNA顯著低于癌旁組織的原因。在人頭頸部鱗癌中，GALR1[10]及GALR2[11]分別被證明有抑制細胞增生和誘導凋亡的作用，本研究中GAL及GALmRNA升高并伴隨受體mRNA表達降低的現象，是否因為配體的高表達而引起受體的代償性下調，或由于受體的下調而導致配體的代償性高表達，及其與癌細胞增生或凋亡的關系，值得進一步的研究。

乳腺癌有多個亞克隆細胞群，不同的細胞群對不同治療方案有不同的敏感性，因此在治療過程中，腫瘤分子表達的特征可能發生改變[12]。GALR1[13]和GALR2[14]與結腸癌對特定化學治療藥物的敏感性有關，HIFU治療也會改變癌細胞的分子表達特征[15]，這可能解釋了在NAC與HIFU組癌組織中3種受體亞型的mRNA雖然降低但差異無統計學意義，GAL及GALmRNA升高但差異亦無統計學意義，且明顯低于術前無治療組的現象。此外，本研究發現經過NAC治療后癌組織中GALR3 mRNA要明顯高于術前無治療組的癌組織，GALR3是否也與乳腺癌化學治療敏感性有關，尚需要進一步研究。綜上，筆者推測GAL及其受體系統參與了乳腺癌對不同治療方案反應的差異性，但其表達情況及與臨床治療方法的關系仍需進一步探討，相關的研究具有一定的臨床指導意義。

總之，本研究顯示了GAL及其受體亞型在乳腺癌中存在差異表達，且與臨床治療方法相關，該研究可能為乳腺癌的診斷、治療及預后提供了新的資料?？紤]到本研究樣本量較少，與患者臨床及病理資料的相關性未能明確，今后，本課題組將進一步收集樣本，完善患者臨床及病理資料，進一步闡明GAL及其受體亞型在乳腺癌中表達的臨床意義。

4參考文獻

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編輯孫超淵

Expression of galanin and its receptor subtypes in human breast cancer

Zhang Shuai1，Deng Jiahui2，Xu Zhiqing3，Qi Xiaodong1*

(1.DepartmentofBreast，theMilitaryGeneralHospitalofBeijing，ClinicalSchoolofAnhuiMedicalUniversity，Beijing100700，China; 2.DepartmentofFunctionalNeurosurgery,SanboBrainHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100093,China; 3.DepartmentofNeurobiology,SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

【Abstract】ObjectiveTo determine the expression of galanin(GAL) and galanin receptor 1、2、3 (GALR1、2、3) in breast cancer and the paired peritumoral tissues; To analyze the relationship between the different clinical therapies and the expression of galanin and its receptor subtypes. MethodsqRT-PCR was performed to detect the mRNA level of galanin and its three receptor subtypes in breast cancer and the paired peritumoral tissues. Western blotting was carried out to detect the GAL protein level in breast cancer and the paired peritumoral tissues. t-test was used to analyze the expression of galanin and its three receptor subtypes in cancer tissues of different groups; while paired t-test was performed to analyze the expression of galanin and its three receptor subtypes in breast cancer and the paired peritumoral tissues of the same group. ResultsThe GAL mRNA and protein levels of cancer tissues were higher than the paired peritumoral tissues in the group of no preoperative treatment (P<0.05, P<0.01), whereas the mRNA levels of GALR1, GALR2 and GALR3 were lower than the paired peritumoral tissue (P<0.05, P<0.05, P<0.01). In the NAC and HIFU groups, there were no significant differences in GAL protein, GAL and its receptors mRNA levels between the cancer and the paired peritumoral tissues (P<0.05, P<0.05, P<0.01). However, the GAL protein and GAL mRNA levels were lower than the group of no preoperative treatment (P<0.05). In addition, the GALR3 mRNA level was higher than the group of no preoperative treatment in the NAC group (P<0.01). ConclusionThe abnormal expression of galanin and its receptor subtypes in breast cancer was relevant to different clinical therapies, which might be used as a potential biomarker for breast cancer diagnosis, therapy and prognosis.

【Key words】breast cancer; galanin; galanin receptor subtypes

(收稿日期：2016-03-10)

【中圖分類號】R 739.9

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.02.020]

*Corresponding author， E-mail：qixiaodongbj@sina.com

基金項目：國家自然科學基金(31171032)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(31171032).

網絡出版時間：2016-04-1221∶13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160412.2113.032.html

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