黃瓜酪氨酸硫化轉移酶基因CsTPST克隆及其表達分析

杜亞琳

摘要：【目的】克隆黃瓜酪氨酸硫化轉移酶基因（CsTPST），并分析植物多肽在發(fā)育過程中的調控作用，為研究CsTPST的功能及多肽與乙烯在黃瓜發(fā)育過程中的相互作用打下基礎。【方法】以擬南芥TPST蛋白序列信息為基礎進行同源比對，經PCR擴增和生物信息學分析獲得CsTPST基因序列信息、結構和親緣關系，并利用qRT-PCR對其表達模式進行分析。【結果】CsTPST基因cDNA全長789 bp，編碼262個氨基酸。進化分析結果表明，CsTPST蛋白與甜瓜的TPST蛋白親緣關系最近，其氨基酸序列相似性為93%。qRT-PCR分析結果表明，CsTPST基因在黃瓜雌花、根和葉片中表達量較高，在雄花和莖中表達量較低。此外，CsTPST基因在乙烯合成促進劑ACC處理的黃瓜葉片中上調表達，而在乙烯合成抑制劑AVG處理下呈下調表達。CsTPST基因啟動子能激活GFP基因的表達。【結論】CsTSPT基因是一個受乙烯誘導表達的基因，可供開展CsTPST基因的生物學功能及性別決定的分子機理研究參考。

關鍵詞： 黃瓜；CsTPST基因；多肽；qRT-PCR；乙烯

中圖分類號： S642.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）09-1457-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to clone tyrosylprotein Sulfotransferases gene in Cucumis sativus L.（CsTPST） and analyze regulatory role of plant peptides in development of C. sativus L.， in order to lay a foundation for analysis of function of CsTPST and interaction between peptide and ethylene in development of C. sativus L.【Method】Homology alignment was conducted based on TPST protein sequence in Arabidopsis thaliana. sequence， gene structure，phylogenetic relationship，and expression pattern of CsTPST were obtained through PCR amplification and bioinformatics analysis， and the expression pattern was studies through qRT-PCR. 【Result】Gene cDNA in CsTPST was 789 bp in length，and encoded a protein with 262 amino acids. Phylogenetic analysis indicated that CsTPST exhibited the highest similarity with TPST from melon，with 93% of amino acid sequence similarity. qRT-PCR analysis showed that CsTPST gene had high expression level in female flowers，roots and leaves，while it had relatively low expression level in male flowers and stems. More interestingly，CsTSPT gene expression was up-related in cucumber leaves under ACC（an ethylene synthesis promoter） treatment，while down-regulated under AVG（an ethylene synthesis inhibitor） treatment. CsTPST gene promoter could activate expression of GFP gene. 【Conclusion】The results revealed that CsTSPT is an ethylene-induced gene， which can provide reference for research on biological function and molecular mechanism of sex determination.

Key words： Cucumis sativus L.； CsTPST gene； peptide； qRT-PCR； ethylene

0 引言

【研究意義】黃瓜（Cucumis sativus L.）性型較豐富，是研究植物性別決定的模式材料，但其調控機制目前尚不明確。植物多肽作為一種新型激素，對植物的多個生長和發(fā)育過程均有調控作用，但其是否調控黃瓜性別決定也尚未明確。因此，研究分析植物多肽在黃瓜發(fā)育過程中的調控作用，對開展植物多肽對黃瓜生長發(fā)育的調控作用研究及利用植物多肽調控黃瓜性型具有重要意義。【前人研究進展】Matsubayashi和Sakagami（1996）、Matsubayashi（2014）研究發(fā)現，植物硫肽激素（Phytosulfokine，PSK）以兩種形式存在，即PSK-α和PSK-β，其中，PSK-α是一種含5個氨基酸的磺化短肽Tyr（S03H）-Ile-Tyr（S03H）-Thr-Gln-0H。Matsubayashi（2011，2014）研究認為，植物多肽（如系統(tǒng)素和PSK）參與了植物生長發(fā)育的多個過程。Yamamuro等（2016）研究發(fā)現，植物激素（如生長素、赤霉素、細胞分裂素和乙烯等）的相互作用可在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要調控作用。PSK作為能剌激植物細胞活性的肽類信號分子存在于多種植物細胞中，對植物生長發(fā)育的其他調節(jié)功能也陸續(xù)被鑒定（Yamada and Sawa，2013；Matsubayashi，2014）。植物多肽通常通過復雜的翻譯后修飾過程來行使其生物學功能，酪氨酸硫化則是一種在高等動物和植物中普遍存在的蛋白質翻譯后修飾現象，此過程由酪氨酸硫化轉移酶（Tyrosylprotein sulfotransferases，TPST）所介導（Matsubayashi，2014）。動物的TPST存在于各種組織和細胞中，在結構上與植物的TPST存在較大差異（Komori et al.，2009；Matsuzaki et al.，2010）。Komori等（2009）、Matsuzaki等（2010）研究表明，植物的TPST在植物多肽激素PSK和PSY1發(fā)揮生物活性過程中尤為重要。目前，人們已從植物中鑒定出TPST基因。擬南芥AtTPST是一個定位于高爾基體的Ⅰ類跨膜蛋白，其在植物的各組織中均可表達且以在根分生組織中的表達量最高（Komori et al.，2009）。此外，AtTPST的表達受生長素和BR誘導（Zhou et al.，2010；Hartmann et al.，2013）。【本研究切入點】黃瓜是我國重要的蔬菜作物，植物激素在黃瓜發(fā)育過程中發(fā)揮重要調控作用，乙烯在黃瓜性別決定過程中的作用尤為重要（Fulton et al.，1995；Wu et al.，2015）。目前有關TPST介導植物多肽PSK調控植物發(fā)育的研究進展較快，但人們對PSK調控黃瓜的發(fā)育進程（如性別決定）了解較少。【擬解決的關鍵問題】克隆黃瓜TPST基因（CsTPST），探明PSK和乙烯在黃瓜發(fā)育過程中的相互作用，為研究黃瓜發(fā)育過程中CsTPST基因的功能、植物多肽對黃瓜生長發(fā)育的調控作用及利用植物多肽調控黃瓜性型等打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

黃瓜津優(yōu)10號購自天津科潤黃瓜研究所，雌性系黃瓜唐秋208購自唐山市農業(yè)科學研究院，強雄黃瓜材料ZL18由農業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室保存提供。2015年春季播種于東北農業(yè)大學農業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室光照培養(yǎng)箱。分別取幼嫩葉片、雌花、雄花、莖和根等組織，用液氮冷凍并于-80 ℃保存，用于RNA提取。

1. 2 激素處理

黃瓜植株采用MGRL營養(yǎng)液配方進行水培。每7 d更換1次營養(yǎng)液。在3葉1心期對黃瓜幼苗葉片分別進行乙烯合成促進劑ACC（1 μmol/L）、乙烯合成抑制劑AVG（1 μmol/L）、IAA、GA3和CTK等激素處理，以ddH2O為對照（CK），每2 d處理1次，共處理3次，最后1次處理后3 d取材并提取RNA用于后續(xù)分析。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法進行總RNA提取，利用單逆轉錄（RT）試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，MBI公司）合成cDNA。

1. 4 基因組DNA提取

取黃瓜植株嫩葉，用CTAB法（Fulton et al.，1995）進行DNA快速提取。提取的DNA加水溶解，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 CsTPST基因克隆

參考擬南芥基因組數據庫中TPST（AT1G08030）序列信息，在黃瓜基因組數據庫（http：//www.icugi.org）中比對獲取其同源基因序列Csa1M126020。利用Primer Premier 5.0設計特異引物（5'-ATGAATGCTATCTTGTGGGGCCTTC-3'和5'-TTATACCTTAACTTTAGATACTCT-3'），PCR擴增CsTPST基因序列，并將PCR產物送至上海英駿生物技術有限公司進行測序。

1. 6 生物信息學分析

將克隆獲得的CsTPST基因序列在NCBI中進行BLAST同源比對分析，并將其蛋白序列與同源基因蛋白序列（擬南芥AT1G08030，甜瓜XP_008462687，麻風樹XP_012064805，荷花XP_010253702，白楊XP_011044393）進行同源性比對。

1. 7 qRT-PCR分析

qRT-PCR分析以β-actin基因作內參，以經ACC（50 μmol/L）、AVG（50 μmol/L）、IAA（50 μmol/L）、GA3（50 μmol/L）和CTK（50 μmol/L）處理的黃瓜葉片及未經激素處理（對照，CK）的不同組織（葉片、根、雌花、雄花和莖）、不同發(fā)育階段（播種后30和50 d）的津優(yōu)10號葉片、雌性系黃瓜唐秋208和農業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室保存的強雄黃瓜材料ZL18莖間為材料，以CsTPST基因的cDNA序列為基礎，利用Primer Primer 5.0設計特異引物（正向引物5'-TCTAACTGCGGAACATAAGGA-3'、反向引物5'-TCTAAGGTACTATTATTCTGA-3'）。qRT-PCR試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司的Real Master Mix SYBR Green Ⅰ，儀器為IQ5實時定量PCR儀（伯樂公司）。基因相對表達量采用2-△△Ct法進行計算，3次重復。

1. 8 啟動子序列分析

將CsTPST基因編碼區(qū)序列在黃瓜基因組網站（http：//www.icugi.org/）進行比對，獲得其在基因組上位置的信息，進而在黃瓜基因組網站上獲得其上游約2000 bp的啟動子序列，并通過啟動子元件分析數據庫PLACE（http：//www. dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/）對CsTPST基因啟動子序列中調控元件進行分析。

為測試CsTPST基因啟動子的活性，利用pGII載體上的多克隆位點（Sac I和BamH I），在35S啟動子兩端設酶切位點，構建帶有GFP報告基因的嵌合啟動子載體。利用基因槍轟擊法在洋蔥表皮細胞中進行瞬時轉化，進而利用激光共聚焦對啟動子活性進行分析。

2 結果與分析

2. 1 CsTPST基因的克隆與序列分析結果

PCR擴增及后續(xù)序列測定結果表明，CsTPST基因cDNA全長789 bp，編碼262個氨基酸（圖1-A）；DNA全長7561 bp。對其結構進行分析，結果表明，CsTPST基因擁有8個外顯子和7個內含子（圖1-B）。進化分析結果表明，CsTPST蛋白與甜瓜TPST蛋白的親緣關系較近，其氨基酸序列相似性為93%，而與擬南芥TPST的親緣關系較遠，其氨基酸序列相似性為45%（圖2）。

2. 2 CsTPST基因的組織表達分析結果

從圖3-A可以看出，CsTPST基因在黃瓜的根和雌花組織中相對表達量顯著高于葉片、雄花和莖（P<0.05，下同），分別為葉片中表達量的2.7和3.6倍；在莖和雄花中相對表達量顯著低于葉片，分別為葉片中表達量的47%和53%。不同發(fā)育階段及不同性型黃瓜材料基因表達分析結果表明，CsTPST基因在營養(yǎng)生長階段（播種后30 d）的表達量顯著高于生殖生長階段（播種后50 d）；在雌性系材料中的表達量顯著高于強雄系（圖3-B）。植物激素與黃瓜性別關系密切，CsTPST基因在ACC處理的黃瓜葉片中上調表達量是CK的2.5倍，而在AVG處理的黃瓜葉片中下調表達量是CK的1/2。此外，CsTPST基因的表達不受IAA、GA3和CTK處理誘導（圖3-C），說明CsTPST基因是一個受乙烯特定誘導表達的基因。

2. 3 CsTPST基因的啟動子序列分析結果

從圖4可以看出，CsTPST基因啟動子中包含參與乙烯和銅反應的W-box、ERE和CuRE等元件。W-box參與了乙烯反應因子基因ERF3在植株遭受傷害后的起始表達（Nishiuchi et al.，2004）；ERE元件介導了乙烯誘導的U3啟動子區(qū)域的轉錄起始活性（Itzhaki et al.，1994）；CuRE元件參與了銅反應因子轉錄起始活性的調控（Kropat et al.，2005）。

為了檢測CsTPST基因啟動子活性，本研究參考基因槍使用說明及有關資料，對洋蔥表皮選擇轟擊條件為1100 psi×9 cm、過渡培養(yǎng)24～36 h、經暗培養(yǎng)后在解剖鏡下觀察（圖5）。結果表明，CsTPST基因啟動子激活了GFP基因的表達，即該基因啟動子具有活性。

3 討論

植物多肽是近年來發(fā)現對植物生長和發(fā)育具有重要調節(jié)作用的新型激素，目前已在植物中鑒定出多個編碼植物多肽基因（Matsubayashi，2011， 2014），其中包括調控多肽發(fā)揮活性的TPST基因（Komori et al.，2009）。本研究通過生物信息學分析和同源克隆技術，從黃瓜葉片克隆得到CsTPST基因，并對其序列和表達進行分析，結果表明，CsTPST基因是一個乙烯誘導表達基因，與Wu等（2015）的研究結果相似。Wu等（2015）研究表明，PSK在乙烯生物合成途徑中發(fā)揮負調控作用。隨著植物體內乙烯含量的增加，為了保證植株正常生長發(fā)育，可能需要產生更多的活性PSK，進而對乙烯反應產生調控作用，而TPST基因的硫基化翻譯后修飾是PSK發(fā)揮生物活性的前提，其表達受到乙烯的上調調控。也有研究結果表明，TPST和PSK與植物激素間有著密切的相互作用，如擬南芥TPST的表達會受到IAA處理的誘導（Zhou et al.，2010），BR對植物多肽PSK具有調節(jié)作用（Hartmann et al.，2013）。植物激素（尤其是乙烯）在黃瓜生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調控作用。

由于性型分化的多樣性，黃瓜可作為研究植物性型分化的一個模式材料。目前已克隆獲得的黃瓜雌性F基因（CsACS1G）和單性花決定M基因（CsACS2）均為乙烯合成酶基因（Mibus and Tatlioglu，2004；Li et al.，2009）。黃瓜是典型的利用雌性系進行雜交一代制種的園藝作物，對其性別決定及性型調控的分子機理進行研究將有助于精確控制黃瓜性型。本研究結果表明，CsTPST基因受到乙烯的誘導表達，暗示CsTPST或植物多肽PSK與乙烯生物合成有相互作用，可能也在黃瓜性別決定過程中發(fā)揮重要調控作用。這為深入研究CsTPST基因的生物學功能及黃瓜性別決定的分子機理提供了新思路。

4 結論

本研究結果表明，CsTSPT基因是一個受乙烯誘導表達的基因，可供開展CsTPST基因的生物學功能及性別決定的分子機理研究參考。

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（責任編輯 思利華）