湖南省稻瘟病菌無毒基因鑒定

劉翔 任佐華 陳娟芳 毛銳 戴良英 劉二明

摘要：【目的】了解湖南省稻瘟病菌無毒基因組成，為培育水稻新品種及合理布局抗稻瘟病品種提供參考依據。【方法】采用2014年分離自湖南桃江病圃麗江新團黑谷（LTH）上的120個稻瘟病菌單孢菌株室內離體針刺接種于24個已知抗瘟基因的水稻近等基因系（NILs）上，對供試菌株進行無毒基因鑒定。【結果】120個稻瘟病菌含有全部24個無毒基因，在24個無毒基因中，出現頻率高于40.00%的有Avr-Pita和Avr-Pish；出現頻率在30.00%～40.00%的無毒基因有Avr-Piz、Avr-Piz5、Avr-Pi3和Avr-Pi9；其余無毒基因出現頻率均較低，特別是Avr-Piks、Avr-Pikp、Avr-Pib、Avr-Pi12和Avr-Pi11出現頻率均低于10.00%。【結論】含抗性基因Pi-ta和Pi-sh的水稻品種可在湖南省推廣利用；含抗性基因Pi-z、Pi-z5、 Pi-3和Pi-9的水稻品種在湖南推廣時應慎重考慮；含抗性基因Pi-ks、Pi-kp、Pi-b、Pi-12和Pi-11的水稻品種不宜在湖南省推廣利用。

關鍵詞： 稻瘟病菌；近等基因系；離體接種；無毒基因；湖南省

中圖分類號： S511 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）09-1500-06

Abstract：【Objective】Composition of avirulent genes types of Magnaporthe oryzae in Hunan province were studied， in order to provide reference basis for breeding of new rice cultivars and rational distribution of blast-resistant cultivars. 【Method】A total of 120 M. oryzae monadic isolates were isolated from rice susceptible cultivars（Lijiangxintuanheigu， LTH） in Hunan Taojiang nurseries in 2014. Then， 24 near-isogenic lines（NILs） with known blast-resistance gene was in vitro inoculated artificially with above isolates by acupuncture， and the avirulent genes of tested isolates were identified. 【Result】The above 120 M. oryzae isolates all carried 24 avirulent genes， among 24 avirulent genes， occurrence frequencies of Avr-Pita and Avr-Pish were more than 40.00%， while occurrence frequencies of Avr-Piz， Avr-Piz5， Avr-Pi3 and Avr-Pi9 ranged from 30.00% to 40.00%， occurrence frequencies of the rest were lower relatively， especially Avr-Piks， Avr-Pikp， Avr-Pib， Avr-Pi12 and Avr-Pi11 with frequency of less than 10.00%. 【Conclusion】The rice cultivars carrying resistant genes Pi-ta and Pi-sh sould be generalized in Hunan province； the rice varieties cultivars carrying resistant genes Pi-z， Pi-z5， Pi-3 and Pi-9 should be considered carefully in their utilization and extension in Hunan province； the rice cultivars carrying blast-resistant genes Pi-ks， Pi-kp， Pi-b， Pi-12 and Pi-11 are not suitable for utilization and extension in Hunan province.

Key words： Magnaporthe oryzae； near-isogenic lines（NILs）； in vitro inoculation； avirulent gene； Hunan province

0 引言

【研究意義】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae，無性世代為Pyricularia oryzae）引起的稻瘟病在全球各稻區每年均有不同程度發生，是水稻上一種嚴重的真菌性病害。目前，稻瘟病已成為水稻豐產的主要障礙，給我國糧食安全帶來了嚴重隱患（李楊等，2010；王偉舵等，2015）。利用抗病品種不僅能有效遏制稻瘟病流行，減少或停止使用殺菌劑，大量節省田間成本，還能避免或減輕因農藥而造成的殘毒和環境污染問題，是防治稻瘟病最安全、經濟和有效的途徑（Liu et al.，2010；文紹山和焦峻，2014）。然而，稻瘟病菌生理小種的遺傳復雜性和頻繁變異，導致新品種的抗性周期一般為3～5年（Zhou et al.，2007），提高水稻品種的抗瘟水平和延長抗病周期是擺在育種家和病理專家面前的共同難題。因此，鑒定獲得廣譜且抗性穩定的抗瘟基因，不斷挖掘和利用優質抗源，對水稻抗病育種具有重大意義（Ou，1972）。【前人研究進展】研究發現，優質抗源主要來源于以下方面：稻瘟病菌多發區域內經長時間自然選擇留下的、通過自身定位抗瘟基因的及野生稻和栽培稻等稻種資源中表現出抗稻瘟病的品種（柏斌等，2012）。蘭波等（2010）以30個水稻抗稻瘟病近等基因系或單基因系為材料，測定來自江西省的195個稻瘟病菌單孢菌株的致病性，結果表明，江西省稻瘟病菌群體含有29個與測試抗病基因相對應的無毒基因，其中60.00%菌株表現出強致病性；2006～ 2008年江西省稻瘟病菌群體中分別出現了24、27、29個無毒基因，其中有24個無毒基因在各年份均有分布；江西省稻瘟病菌單孢菌株無毒基因組合數目為0～18個；白珍安（2011）對2009年在湖南桃江和瀏陽兩病圃中分離得到的154份稻瘟病單孢菌株進行無毒基因鑒定，結果顯示，供試品系群體參與組合的菌株數為3～15個，菌株數為6、7、8、11和12的組合類型較多；童建新（2012）于2010年在湖南桃江病圃中麗江新團黑谷（LTH）上分離得到103份稻瘟病菌品系，其中供試品系群體參與組合的菌株數為4～22個，組合類型較多的菌株數為14、15、16、17、19個；虞選杰（2014）于2012年在湖南桃江病圃中LTH上分離得到100份稻瘟病菌品系，研究發現供試品系群體參與組合的菌株數為0～18個，組合類型較多的菌株數為1個。【本研究切入點】湖南桃江病圃種植的水稻品種和育種材料年均在1000份以上，稻瘟病菌遺傳多樣性豐富而復雜。本課題組近年來研究湖南省稻瘟病菌群體的遺傳變異分布格局，發現LTH上的稻瘟病菌遺傳具有明顯的多樣性，能代表特定稻區稻瘟病菌遺傳組成。目前，對湖南桃江稻瘟病菌群體遺傳結構組成及動態研究的文獻報道較少。【擬解決的關鍵問題】采用2014年分離自湖南桃江病圃麗江新團黑谷上的120個稻瘟病菌單孢菌株室內離體針刺接種于24個已知抗瘟基因型的水稻近等基因系上，對供試菌株進行無毒基因鑒定，以掌握湖南稻瘟病菌無毒基因組成，為培育水稻新品種和合理布局抗稻瘟病品種提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 供試材料

24個近等基因系水稻（NILs）和對照高感品種麗江新團黑谷（LTH）由中國農業大學植物病理學系彭友良教授提供，所含單基因見表1。120個稻瘟病菌單孢菌株于2014年分離自湖南桃江病圃LTH上。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 育苗 使用集調酸（pH 4.5左右）、肥料和殺菌為一體的特制育苗調節劑均勻混拌在腐殖土3～5 cm的土層中作為育苗土。供試種子經曬種后裝在針刺過的塑料袋中，于26～28 ℃用清水浸泡2 d，期間換水2～3次；浸種結束后，在搪瓷盤中于35 ℃下高溫破胸1 d，當種子露白時28～30 ℃催芽1～2 d，搪瓷盤底鋪濕報紙、上鋪吸水紗布以促進芽的生長。

準備25個育苗盤（26 cm×19 cm×7 cm），每盤種植1個品種，待種子芽長達0.1 cm左右時將其均勻撒播在盤內，待長至5葉1心時供接種使用。

1. 2. 2 菌株產孢培養 用番茄燕麥培養基（番茄汁150 mL、燕麥片40 g、CaCO3 0.6 g，定容至1000 mL）對稻瘟病菌單孢菌株進行活化，7～10 d后菌落直徑為整個培養基的2/3時加入1 mL無菌水，用涂抹棒將菌落上的菌絲和孢子刮落，得到稻瘟病菌懸液，用微量移液槍吸取菌懸液轉接至新的培養基上并涂抹均勻，當傾斜培養基無明顯液滴時封口并置于27 ℃光照培養箱中培養。培養2～3 d后，培養基表面重新長滿一層氣生菌絲，用棉棒擦拭以打斷氣生菌絲，并用無菌水沖洗培養基表面，待晾干后以報紙為皿蓋包裹，27 ℃下光照黑暗交替培養1～2 d，即可產生大量分生孢子（張國珍等，2002）。

1. 2. 3 孢子懸浮液制備 取培養好的稻瘟病菌分生孢子，用無菌水配制成分生孢子濃度為2×105個/mL。接種前在配置好的分生孢子懸液中加入1‰ Tween-20懸浮液，供接種使用。

1. 2. 4 針刺離體接種 接種前3 d將試驗用塑料培養皿洗凈并放入接種室內進行消毒，事先準備好無菌水、手套及滅菌濾紙片、牙簽等物品。接種前1 d給接種室通風，同時準備培養皿（濕潤的濾紙在下，上放兩根牙簽）。選取尚未完全展開的供試水稻嫩葉并剪成長短均勻的3片葉段，均勻針刺其得到傷口，將葉段置于鋪有濾紙和牙簽的培養皿中。先用濕濾紙條壓住葉段的一端，使葉段彎曲形成拱狀并壓住另一端，以防止葉片與濕濾紙相接觸而導致菌液無法懸浮于葉片上，最后貼上標簽備用。

用10 μL的移液器吸取5 μL上述制備的孢子懸浮液，均勻接種于葉片上，每片3滴。離體穗段接種孢懸液后，人為控制發病條件鑒定120個供試菌株與24個NILs的親和反應類型。為保證接種室內的環境因素能滿足病菌侵染需要，培養皿下鋪有濕潤的保鮮膜和卷筒紙（保鮮膜在最下方），上鋪一層濕潤保鮮膜，調節溫度恒定在28 ℃，先黑暗處理2 d，其后黑暗光照交替培養2～5 d，對NILs的發病情況進行統計并拍照。

1. 3 調查項目及方法

1. 3. 1 調查方法 當葉片無病斑或有黑褐色壞死斑，且中心無產孢區時為抗病，記為R（圖1）；當病斑較大，中間灰白色，邊緣褐色或外圍有黃色暈圈時為感病，記為S（圖2）。

1. 3. 2 菌株致病率及菌群毒力頻率計算 單個稻瘟病菌株的致病率（Pathogenic frequency，PF）及致病力類型劃分參考楊秀娟等（2007）的方法。PF（%）=感病水稻品種數/所有測試的水稻品種數×100；當PF≥70.0%時為強致病力，70.0%>PF≥50.0%時為較強致病力，50.0%>PF≥20.0%時為中等致病力，PF<20.0%時為弱致病力。

稻瘟病菌群體的毒力頻率（Virulence frequency，VF）及毒力類型劃分參考周江鴻等（2003）的方法。VF（%）=對測試水稻品種有毒力的菌株數/所有菌株數×100；當VF≥70.00%時為強毒力，70.00%>VF≥50.00%時為較強毒力，50.00%>VF≥20.00%時為中等毒力，VF<20.00%時為弱毒力。

1. 4 統計分析

根據供試菌株對NILs的致病情況建立0-1數據庫，抗病記為1，感病記為0。用DPS數據處理系統中的Nei&Li方法進行聚類分析，對供試菌株進行類別劃分并綜合衡量其遺傳差異大小，利用多元統計學方法中的最長距離法構建其遺傳關系樹狀圖（白珍安，2011）。

2 結果與分析

2. 1 120個稻瘟病菌對24個NILs的致病率

用120個稻瘟病菌單孢菌株對24個分別含不同抗瘟基因的近等基因系水稻材料進行抗性鑒定，結果表明，高感對照品種LTH全部發病，120個供試菌株對供試24個NILs的致病率為40.0%～100.0%。其中，PF≥70.0%的菌株有92株，占總菌數的76.67%；70.0%>PF≥50.0%的菌株有24株，占總菌數的20.00%；50.0%>PF≥20.0%的菌株有4株，占總菌數的3.33%。供檢測用稻瘟病菌菌株多表現為強或較強致病性，說明湖南桃江病圃中LTH上的稻瘟病菌以廣譜強致病性菌株為主，對供試已知抗性基因的水稻材料有較強的致病能力。

2. 2 120個稻瘟病菌對24個NILs的毒力頻率

從表2可知，供試120個稻瘟病單孢菌株對24個已知抗瘟基因的水稻材料表現出不同程度的毒力，平均毒力頻率為77.22%。毒力頻率最高的抗性基因是Pi-kp（96.67%），最低的是Pi-sh（55.00%）；毒力頻率介于60.00%～70.00%的抗性基因有4個，分別為Pi-z、Pi-z5、Pi-3和Pi-9，推廣其相應的水稻品種時應慎重考慮；其余抗瘟基因的毒力頻率大多高于70.00%，屬強毒力，特別是Pi-ks、Pi-kp、Pi-b、Pi-12和Pi-11的毒力頻率高于90.00%，說明其抗病基因對湖南省稻瘟病菌幾乎失去抗性，含有這些抗性基因的水稻品種在湖南省推廣利用的價值不高。

2. 3 稻瘟病菌無毒基因分析

用24個已知抗性基因的NILs對120個供試菌株進行無毒基因鑒定，針刺離體接種結果顯示，供試菌株中含所有上述NILs相對應的無毒基因，其中，Avr-Pita和Avr-Pish的出現頻率在40.00%以上；Avr-Piz、Avr- Piz5、Avr-Pi3和Avr-Pi9的出現頻率為30.00%～40.00%；其余無毒基因出現頻率均較低，尤其是Avr-Piks、Avr-Pikp、Avr-Pib、Avr-Pi12和Avr-Pi11在供試菌株中的出現頻率低于10.00%。

2. 4 稻瘟病菌無毒基因組合

120個稻瘟病菌株中分別含有2～22個數目不等的基因組合，共13個類型，其中含11、15、21和22個無毒基因組合的菌株占較大比例，合計占供試菌株群體的57.50%（表3）。

2. 5 供試菌株對24個NILs的致病性分化

120個供試菌株對24個NILs的致病率在40.0%～ 100.0%，聚類分析發現，致病率接近及相同的菌株在致病相似性上差異很明顯（圖3）。如80、84、85和86號菌株的致病率均為87.5%，但致病性的遺傳距離有明顯差異；又如24、54和114號菌株致病率分別為87.5%、91.7%和91.2%，致病相似性差異小，但三者的相似系數為0.4，表明供試菌株存在致病性分化現象。

3 討論

本研究利用24個已知抗瘟基因型的NILs對2014年分離自湖南桃江病圃LTH上的120個稻瘟病單孢菌株進行無毒基因鑒定，結果表明，供檢測用稻瘟病菌菌株多表現為強或較強致病性。蘭波等（2010）認為病原菌的毒力頻率不僅可反映其自身的毒性，還能反映寄主的抗病性。本研究發現，毒力頻率高于90.00%的抗性基因為Pi-ks、Pi-kp、Pi-b、Pi-12和Pi-11，說明其抗病基因對湖南省稻瘟病菌幾乎失去抗性，生產中應避免使用含有相應基因的水稻品種；毒力頻率介于60.00%～70.00%的抗性基因有Pi-z、Pi-z5、Pi-3和Pi-9，在推廣與其相應的水稻品種時應慎重考慮。

稻瘟病菌無毒基因與水稻抗病基因間的互作機制符合Flor的“基因對基因假說”（虞選杰，2014）。本研究結果表明，供試稻瘟病菌菌株含有與所有測試抗瘟基因相對應的24個無毒基因，并以不同的頻率出現，其中，Avr-Piz、Avr-Piz5、Avr-Pi3和Avr-Pi9的出現頻率為30.00%～40.00%，因此，含有Pi-z、Pi-z5、Pi-3和Pi-9抗性基因的水稻材料在湖南省內推廣前需進行田間自然誘發鑒定，綜合評價它們在湖南省的利用價值。

童建新（2012）和虞選杰（2014）的研究結果表明，分離自LTH上的單孢菌株群體遺傳結構相比于其他栽培品種上稻瘟病菌的群體遺傳結構更具代表性，因此本研究的供試菌株具有一定代表性，但由于湖南省地形復雜，水稻栽培品種多樣，這些菌株并不能完全反映湖南省稻瘟病菌群體的自然狀況，今后仍需多地采集LTH感病標樣分離稻瘟病菌單孢菌株，測定其無毒基因的組成及分布。本研究結果同時證明了稻瘟病菌存在復雜的致病性分化，在稻瘟病菌與水稻品種協同進化過程中，病菌中的無毒基因組成會隨著水稻抗病基因組成的變化而發生相應變動。理論上，水稻品種多樣性有利于稻瘟病菌群體的多樣性，不利于稻瘟病菌優勢生理小種的產生，進而在一定程度上減輕稻瘟病的危害。因此，除了選育含新的抗瘟基因的水稻品種外，還應注意抗瘟基因的合理布局。

4 結論

本研究結果表明，供試120個稻瘟病菌菌株中含有全部24個無毒基因，在24個無毒基因中，僅Avr-Pita和Avr-Pish的出現頻率高于40.00%，可以考慮在湖南省推廣利用含有與之相對應的抗性基因的水稻品種；Avr-Piz、Avr-Piz5、Avr-Pi3和Avr-Pi9的出現頻率為30.00%～40.00%，在推廣相應的水稻品種時應慎重考慮；其余無毒基因的出現頻率均較低，特別是Avr-Piks、Avr-Pikp、Avr-Pib、Avr-Pi12和Avr-Pi11的出現頻率低于10.00%，說明其抗病基因對湖南省稻瘟病菌幾乎失去抗性，含有上述抗性基因的水稻品種不宜在湖南省推廣利用。

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（責任編輯 麻小燕）