一株產木聚糖酶菌株的鑒定及產酶條件研究

吳小建 吳圣進 汪茜 韋仕巖 王燦琴

摘要：【目的】對一株從木薯渣堆中分離得到的產木聚糖酶嗜熱真菌JG-50菌株進行分類鑒定，并研究其利用木薯渣固態發酵產酶的最佳條件，為該菌株在農業有機廢棄物發酵利用中的應用提供理論依據。【方法】采用真菌形態學觀察和26S rDNA基因D1/D2區序列同源性分析方法對JG-50菌株進行分類鑒定，并以單因素試驗方法對JG-50菌株產木聚糖酶的最佳碳源、氮源、培養時間、培養溫度和培養基初始pH等發酵條件進行優化。【結果】菌株JG-50與嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus isolate MTCC 4890）的26S rDNA序列相似性為99%，結合形態學特征初步鑒定為嗜熱子囊菌屬的一種。該菌株能以木薯渣為碳源固態發酵產木聚糖酶，其產酶的最佳條件為：以木薯渣為碳源，添加60%麥麩，0.3%蛋白胨和0.2%酵母粉，pH 6.0，以此培養基50 ℃培養8 d，木聚糖酶活可達4625.4 U/g（干培養基）。【結論】嗜熱真菌JG-50具有較強的產木聚糖酶能力，在農業有機廢棄物發酵利用領域具有良好的應用前景。

關鍵詞： 嗜熱子囊菌；分類鑒定；木聚糖酶；木薯渣

中圖分類號： Q939.96 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）09-1522-06

Abstract：【Objective】A xylanase-producing thermophilic fungi strain JG-50 isolated from cassava residue was classified and identified， and its fermentation conditions for enzyme production was optimized， in order to provide technical support for its application in agricultural organic waste fermentation utilization. 【Method】Strain JG-50 was identified based on morphologic observation and sequence homology analysis of D1/D2 domain of 26S rDNA gene. The fermentation conditions including carbon source， nitrogen source， culture time， culture temperature and initial pH were optimized by single factor test， for producing xylanase by strain JG-50. 【Result】26S rDNA sequences similarity was as high as 99% between strain JG-50 and Thermoascus aurantiacus isolate MTCC 4890. Based on morphological observation and data of 26S rDNA sequences alignment， the strain JG-50 was identified as T. aurantiacus. Strain JG-50 was able to produce xylanase during solid state fermentation using cassava residue as carbon resource， and the optimal fermentation substrate were， 60% of wheat bran， 0.3% of peptone and 0.2% yeast powder， with pH of 6.0. In the above substrate， the enzyme activity of xylanase reached 4625. 4 U/g after fermenting for 8 days at 50 ℃. 【Conclusion】Strain JG-50 has a considerable ability of producing xylanase， and shows good application prospect on fermentation utilization of agricultural organic waste.

Key words： Thermoascus aurantiacus； classification and identification； xylanase； cassava residue

0 引言

【研究意義】半纖維素是農作物秸稈等植物材料的重要組成成分，其含量僅次于纖維素，而木聚糖是植物半纖維素的主要成分。木聚糖酶是一類可以將木聚糖降解成低聚糖和木糖的水解酶，主要包括內切β-1，4-木聚糖酶（β-D-1，4-xylanase， EC 3.2.1.8）、外切β-1，4-木聚糖酶（β-D-1，4-xylanase， EC 3.2.1.92）和β-木糖苷酶（β-1，4-xylosidase， EC 3.2.1.37）。內切β-1，4-木聚糖酶是木聚糖降解酶中最關鍵的酶，其以內切方式水解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷鍵，水解產物主要為不同聚合度的木寡糖和少量木糖（Collins et al.，2005）。木聚糖酶對半纖維素物質的降解對于秸稈資源的利用具有重要意義，已被廣泛應用于生物轉化、食品、飼料、醫藥、能源和造紙等行業（Collins et al.，2005；包怡紅和李雪龍，2006；Nortey et al.， 2007）。但木聚糖酶應用于工業生產中多數需要具備嗜熱或嗜堿的特性，至今為止，關于嗜熱嗜堿特性的木聚糖酶僅有10余種（柏文琴等，2014），與已經分離到的數百個木聚糖酶資源相比，嗜熱嗜堿木聚糖酶的數量非常有限。生產應用酶制劑除了考慮酶活性及表達量外，還需根據不同的應用條件考慮其穩定性（包怡紅和李雪龍，2006），因此，分離選育適應能力強和產酶能力高的微生物菌株仍是木聚糖酶生產應用的關鍵。同時，利用廉價的農業廢棄物如秸稈、玉米芯、蔗渣和麩皮等誘導生產木聚糖酶能有效降低酶制劑的生產成本（李秀婷等，2004），也是木聚糖酶生產利用的主要發展方向之一。【前人研究進展】木聚糖酶廣泛存在于細菌、霉菌和酵母菌等微生物中（萬紅貴等，2001），其中霉菌如嗜熱棉毛菌、木霉、曲霉和青霉等因產酶能力強而備受關注（宋紅霞等，2011）。目前研究較多的是木霉、曲霉和細菌所產生的木聚糖酶，不同來源的木聚糖酶其酶學性質也有所差異（Wong et al.，1988），工業生產中多數需要具備耐熱、耐酸堿特性的木聚糖酶，因此，有不少科研工作者從土壤、酸堿等極端環境中篩選產木聚糖酶的菌株，以期獲得具有相應特性的木聚糖酶。龐宗文等（2012）從土壤中分離到一株高產木聚糖酶的嗜熱子囊菌，其最佳產酶條件為：玉米芯∶麩皮=7∶3（w/w）；最佳氮源為酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源，添加量1.5%；吐溫-80添加量0.5%，初始pH 7.2，培養基水含量80%，250 mL三角瓶裝料量8 g，發酵溫度50 ℃，發酵時間72 h；該酶最適溫度為75 ℃，最適pH 4.5，在70 ℃以下具有良好的穩定性。單志瓊等（2012）從鹽堿湖土壤中篩選到25株產堿性木聚糖酶菌株，所產木聚糖酶具有較好的熱穩定性和堿穩定性。目前，利用農業廢棄物產木聚糖酶的報道較多，常見的麩皮、麥稈、玉米芯、稻稈、稻殼、高粱稈、甘蔗渣等均可誘導生產木聚糖酶（吳萍和姚伍，2006；叢倩千等，2009），利用此類農業廢棄物作誘導底物能有效降低生產成本，產生的木聚糖酶也適合于工業應用。【本研究切入點】廣西是我國第一大木薯生產省份，木薯生產加工產生大量的木薯渣。目前對木薯渣的再利用主要有制作肥料、飼料，栽培食用菌，制沼氣等（劉倩等，2012），利用木薯渣發酵產木聚糖酶的研究報道較少。【擬解決的關鍵問題】采用真菌經典形態學鑒定結合現代分子生物學鑒定技術，對一株從廢棄木薯渣堆中分離獲得的產木聚糖酶的嗜熱真菌JG-50進行分類鑒定，并進一步采用單因素試驗研究其利用木薯渣為碳源生產木聚糖酶的適宜條件，旨在獲得能利用木薯渣等農業有機廢棄物發酵產木聚糖酶的優良菌株，為該菌株在農業有機廢棄物發酵中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試菌株JG-50分離自廣西金光農場木薯渣堆積物，保存于廣西農業科學院微生物研究所。樺木木聚糖購自Sigma公司，3，5-二硝基水楊酸（DNS）等其他試劑均為國產分析純。斜面培養基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL，pH為自然值，在121 ℃下滅菌20 min。液體種子培養基（g/L）：（NH4）2SO4 1.4、MgSO4·7H2O 0.3、KH2PO4 2.0、CaCl2 0.3、FeSO4·7H2O 0.005、MnSO4·H2O 0.0016、ZnSO4·7H2O 0.0014、CoCl2·7H2O 0.002、酵母提取物1.0、蛋白胨3.0、葡萄糖10.0，pH調至6.0，在121 ℃下滅菌20 min。固體發酵培養基：木薯渣，用不含葡萄糖的液體種子培養基調節水含量為60%，在121 ℃下滅菌30 min。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株培養條件 將目的菌株從斜面接入裝有50 mL種子培養基的250 mL錐形瓶，于50 ℃下160 r/min恒溫培養3 d，再以2%的接種量將菌種接入固體發酵培養基，于50 ℃恒溫培養7 d。

1. 2. 2 菌株形態鑒定 參考《真菌鑒定手冊》（魏景超，1979）， 通過觀察菌落特征，菌絲形態，孢子形態、大小及產孢類型等對菌株進行經典形態學鑒定。

1. 2. 3 菌株26S rDNA鑒定 通過PCR擴增真菌基因組26S D1/D2區，其中正向引物26S-F： 5'-GCATATC

AATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物26S-R： 5'-

GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。PCR反應體系（100.0 μL）：10×擴增緩沖液10.0 μL，dNTPs（每種2.5 mmol/L）8.0 μL，引物（10 μL/L）各2.5 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）1.3 μL，無菌超純水補足至100.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性5 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，進行35個循環；72 ℃延伸8 min。將擴增條帶進行膠回收后送至生工生物工程（上海）股分有限公司測序。測序后所得序列提交GenBank進行BLASTn比對，用ClustalX 1.8進行多序列比對分析，利用MEGA 4.0中的Neighbor-Joining法構建系統發育進化樹。

1. 2. 4 發酵粗酶液制備與部分純化 粗酶液制備：取固態發酵好的培養物10 g，加入100 mL蒸餾水，于40 ℃下浸提2 h，過濾，于4 ℃下5000 r/min離心30 min，上清液即為粗酶液。硫酸銨沉淀：取7支試管，各加入10 mL粗酶液，分別加硫酸銨至飽和度30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，于4 ℃過夜后10000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀溶于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0，下同），測酶活和蛋白含量。粗酶純化：參照硫酸銨沉淀中確定的硫酸銨濃度進行分級沉淀，收集飽和度40%～60%的沉淀，沉淀再用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解并置于相同緩沖液4 ℃透析過夜，凍干備用。

1. 2. 5 酶活性和蛋白測定 DNS液配制和木糖含量測定參照Miller（1959）的方法。酶活性測定參照Bailey等（1992）的方法：取適當稀釋的酶液0.5 mL，加入1.5 mL 1%木聚糖溶液，70 ℃恒溫水浴，精確反應10 min，立即加入3.0 mL DNS溶液，沸水浴12 min，置于冰上定容至50.0 mL，于490 nm處測吸光值并參照木糖標準曲線求得木糖含量，計算酶活；空白組不經過70 ℃恒溫水浴直接加入DNS溶液反應。酶活性單位定義：每分鐘產生1 μmol還原糖（以木糖計）所需的酶量為1個酶活性單位，以U/mL（g）表示。

酶活性計算公式：E=nC×1000/MT。式中，E為酶活性（U/mL）；n為稀釋倍數；C為木糖含量（g/L）；M為木糖分子量（150）；T為反應時間（min）。

蛋白測定：參照考馬斯亮藍法測定蛋白含量，標準蛋白為牛血清白蛋白（BSA）。

1. 2. 6 發酵產酶條件研究 最佳培養時間的確定：將菌株接入固體發酵培養基中，于50 ℃培養21 d，每2 d取樣1次，測定酶活力；初始pH對產酶的影響：將固體發酵培養基的初始pH分別調節為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5，接種菌株后50 ℃下培養8 d，測定酶活力；發酵溫度對產酶的影響：將菌株接入固體發酵培養基中后，分別在40、45、50、55和60 ℃下培養8 d，測定酶活力；可溶性碳源對產酶的影響：分別以1%蔗糖、乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉替代液體種子培養基中的1%葡萄糖，再用這些液體培養基配制固體發酵培養基，接種菌株后在50 ℃下培養8 d，測定酶活性；氮源對產酶的影響：分別以NH4NO3、KNO3、蛋白胨、尿素和牛肉膏替代液體發酵培養基中的（NH4）2SO4，在50 ℃下培養8 d，測定酶活力。

2 結果與分析

2. 1 菌種鑒定

2. 1. 1 形態學特征 JG-50菌株在PDA培養基上培養，30 ℃以下不生長，50 ℃下菌絲生長迅速，培養2 d菌落滿皿（直徑90 mm），初期菌落正反面均白色，有叢狀立起的氣生菌絲，高10～16 mm，3 d后菌落表面有白色顆粒狀出現，4 d后轉為紅褐色，粉狀，輻射狀，圓形，邊緣整齊，5～6 d左右產生黃色或棕色的水珠狀分泌物，后期菌絲均為匍匐狀（圖1-a、圖1-b、圖1-c）。分生孢子梗直立，菌絲無色，壁光滑，粗細不等，直徑1.5～12.5 μm（圖1-d、圖1-e）；分生孢子著生于菌絲末端，0～2個隔膜，顏色較菌絲稍深，球形至紡錘形，壁光滑，窄端平截，長13.0～17.5 μm，寬10.0～15.0 μm。子囊果單生或群生，紅棕色，球形或不規則形；子囊易消解，亞球形或橢圓形，長10.0～13.0 μm，寬6.0～8.0 μm，內含8個不規則排列的子囊孢子；子囊孢子透明，長5.0～7.0 μm，寬4.0～5.0 μm（圖1-f）。

嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）共包括6個種及變種，其模式菌株T. aurantiacus Miehe由Miehe于1907年從自熱干草中分離并描述，本研究分離獲得的菌株在形態上與T. aurantiacus相同，因此鑒定為該菌。

2. 1. 2 26S rDNA序列分析結果 菌株的PCR擴增產物電泳結果如圖2所示。

菌株JG-50的26S rDNA序列全長為575 bp，比對結果顯示菌株JG-50與嗜熱子囊菌MTCC 4890菌株有99%的相似性。與GenBank數據庫中相關嗜熱真菌菌株的26S rDNA序列進行比較，用MEGA 4.0進行分析，按Neighbor-Joining法構建系統發育進化樹，結果如圖3所示。JG-50菌株與Dichotomomyces cejpii菌株相距最遠，與Byssochlamys verrucosa和Thermoascus aurantiacus isolate MTCC 4890遺傳距離最近，但Bysso-

chlamys verrucosa 屬耐熱真菌，20 ℃下仍可生長，而本研究分離到的JG-50菌株在30 ℃以下不能生長，結合形態學觀察結果，判斷JG-50菌株為嗜熱子囊菌。

2. 2 JG-50菌株產酶條件研究

2. 2. 1 不同培養時間對JG-50菌株產酶的影響 由圖4可知，在培養初期，木聚糖酶活性不斷上升，至第8 d達150.9 U/g，繼續培養至21 d，酶活性始終維持在150.0 U/g左右，綜合考慮培養時間與生產成本，最佳產酶培養天數為8 d。

2. 2. 2 初始pH對JG-50菌株產酶的影響 由圖5可知，在pH 4～10時JG-50菌株產木聚糖酶活性均維持在較高水平，但以pH 5下生長最快，因此培養基最佳初始pH為5。

2. 2. 3 培養溫度對JG-50菌株產酶的影響 由圖6可知，培養溫度在40～50 ℃時JG-50菌株均維持在較高的產酶水平，但50 ℃下菌絲生長速度最快，故確定該溫度為最佳產酶溫度。

2. 2. 4 可溶性碳源對JG-50菌株產酶的影響 菌株JG-50在添加不同可溶性碳源的木薯渣基質中培養，以添加纖維二糖的產酶量最高，添加其他碳源與不添加可溶性碳源相比差異不明顯（圖7）。

2. 2. 5 氮源對JG-50菌株產酶的影響 菌株JG-50在添加不同氮源的木薯渣基質中培養的產酶水平（圖8）表明，添加無機氮源無促進產酶作用，而添加有機氮源如麥麩、米糠、黃豆粉和豆粕對產酶均有促進作用，其中麥麩的促進作用最明顯。

2. 2. 6 添加不同比例的麥麩對JG-50菌株產酶的影響 不同氮源對JG-50菌株產酶的影響試驗結果表明，麥麩的促進作用最明顯。通過添加不同比例的麥麩研究其對JG-50產酶能力的影響，結果（圖9）顯示，隨著麥麩添加比例的增加，JG-50的產酶能力也隨之上升，至麥麩添加比例為60%時菌株產酶能力達峰值。

3 討論

木聚糖酶是一類重要的木糖苷鍵水解酶，在食品和發酵等可再生資源生物轉化利用中發揮重要作用（萬紅貴等，2010；彭靜靜，2014），但目前商業化木聚糖酶數量不多。Wong等（1988）指出不同來源的木聚糖酶其酶學性質存在差異。李秀婷等（2004）以麥麩和玉米芯粉（8∶2）為復合碳源（99%）， 酵母膏和胰蛋白胨（1∶1）為復合氮源（1%）培養嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus CBS288.54-M18）生產木聚糖酶，其活力高達15023 U/g（干基碳源），但其固態發酵培養料以麥麩為主，成本較高。龐宗文等（2012）以從土壤中分離到的嗜熱子囊菌為發酵菌株，優化了以玉米芯∶麩皮為碳源的產酶條件，取得了較高的酶活性，同時也分析了以木薯渣作為單一碳源對其酶活性的影響，但未對以木薯渣為碳源的產酶條件進行優化。本研究以從廢置木薯渣堆中分離得到的嗜熱真菌為發酵菌株，利用木薯渣發酵產木聚糖，在最佳產酶條件下，木聚糖酶活性可達4625.4 U/g（干培養基）。對比李秀婷等（2004）和龐宗文等（2012）的研究結果，發現JG-50菌株的木聚糖酶活性偏低，可能是本研究采用木薯渣為主要碳源導致培養基透氣性較差，影響菌株產酶能力。Maciel等（2008）采用甘蔗渣（65%）和豆粕（35%）為培養基固態發酵培養黑曲霉LPB326生產木聚糖酶，培養4 d酶活性達3099.0 U/g（干培養基）；本研究與之相比培養時間較長，需發酵8 d，但酶活性更高。由此可見，本研究在利用木薯渣生產木聚糖酶中具有一定的應用前景，后續研究可進一步考察所產木聚糖酶耐熱及耐酸堿性及相關酶學特性，為其實際生產應用提供數據支持和理論依據。

4 結論

嗜熱真菌JG-50菌株具有較強的產木聚糖酶能力，在農業有機廢棄物發酵利用和食用菌栽培料生產等領域具有很好的應用前景

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（責任編輯 麻小燕）