中國常用橡膠樹品種鑒定方法研究

王生瑞 王師笈 朱軍 黃家權

摘 要 橡膠樹（Hevea brasiliensis）產生的膠乳是天然橡膠的最重要來源，不同品種產生膠乳的能力不同，但不同的橡膠樹品種形態差異小，難以區分。利用簡單的方法區分不同的橡膠樹品種具有重要的意義。以天然橡膠生物合成相關的7個基因家族中的目的基因及啟動子序列為模板，設計基因特異的PCR引物16對，分別擴增21個橡膠樹栽培品種的基因組DNA，擴增條帶的多態性可將19個品種區分開（除了云研77-4和南華1號外）。再利用橡膠小粒子編碼蛋白基因（SRPP2）特異的引物，擴增云研77-4和南華1號的SRPP2基因，PCR反應產物直接測序，通過單核苷酸水平上的差異可準確的將二者區分開。本研究通過簡單的PCR擴增及其擴增產物的直接測序，建立了一種穩定性好、簡單快速、經濟高效的鑒定橡膠樹品種的方法。

關鍵詞 橡膠樹；克隆；引物設計；品種鑒定；單核苷酸差異

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract The latex of the rubber tree（Hevea brasiliensis） is the most important source of natural rubber. The ability of latex production and adaptability of different rubber tree clones varied greatly， however， it is difficult to distinguish clones based on morphological traits， which is an important task in field work. In this study， sixteen pairs of gene specific primers were designed basing on gene and promoter sequences of genes related to natural rubber biosynthesis， these primer pairs were used respectively to amplify the genomic DNA of 21 rubber tree clones widely grown in China. The results showed that banding profile of these primer pairs could distinguish the 19 rubber tree clones， except Yunyan77-4 and Nanhua1. PCR amplification products using gene（SRPP2 encoding small rubber particle protein）specific primers were used for sequencing analysis， these two clones could be distinguished based on single nucleotide differences. In this study， a simple， stable and cost effective method using PCR band profile and PCR product sequencing to identify rubber tree clones was established.

Key words Rubber tree；Clone；Primer design；Clone identification；Single nucleotide difference

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.001

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產于巴西亞馬遜河流域赤道氣候帶，為多年生喬木，是典型的熱帶雨林樹種。天然橡膠是橡膠樹的次生代謝物，具有耐高溫和高彈性等突出優點，是世界性工業原料和重要的戰略物資，具有極高的經濟價值及應用前景。在2 000多種產膠植物中，橡膠樹是唯一大規模商業化種植的產膠植物。近年來，隨著世界對天然橡膠需求量的不斷增加，橡膠樹栽培面積也迅速擴大。中國是天然橡膠的消費和生產大國，自1906年起就開始種植橡膠樹，但受自然條件限制，橡膠樹僅分布在海南、廣東、云南等地。

目前世界上栽培的橡膠樹品種均來自魏克漢種質，并通過引種、雜交等育種手段，選育和推廣了多個高產優質的橡膠樹品種。中國在生產中也使用了大量的橡膠樹品種，僅中國栽培的橡膠樹就超過了20種，并且早在20世紀70年代引進的RRIM600仍然在廣泛種植。為了加快品種的更新換代，了解不同橡膠樹品種的分布，以及在進行野外調查時確定調查對象的遺傳背景，需要簡單、快速、準確的橡膠樹品種鑒定方法。

植物品種鑒定方法主要包括形態學鑒定法、物理化學鑒定法、生化鑒定法和DNA分子標記指紋圖譜鑒定法等[1]。目前國內外品種鑒定仍以形態學鑒定為主，但形態標記的表現受環境影響較大、鑒定工作量大、周期長、受季節限制[2-3]，并且橡膠樹不同材料之間的差別較小，對普通的工作者而言，難以區分。近年來，分子標記方法（RFLP、AFLP、SSR、ISSR、SRAP、TRAP、SNP）的開發和利用在作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、種質資源鑒定等方面的研究取得了一定的研究進展[4-5]，這些技術可被用來有效的區分不同的品種，但這些技術的操作技術復雜，對DNA質量要求高，時間長，費用相對較高[6-7]。因此，亟需開發穩定性好、簡單快速、經濟高效的橡膠樹品種鑒定方法。

本研究以天然橡膠生物合成相關的7個基因家族中的部分目的基因及啟動子序列為模板，設計16對特異性擴增引物，對中國熱帶農業科學院橡膠研究所國家橡膠樹種質圃保存的且在中國生產上廣泛利用的21份魏克漢種質進行PCR擴增，結合PCR產物測序，以期建立一種簡單快速、穩定且經濟高效的橡膠樹品種鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

所有的橡膠樹材料均來自于中國熱帶農業科學院橡膠研究所國家橡膠樹種質圃。采集橡膠樹淡綠期的幼葉，鋁箔包裹，作好記號后，放入液氮罐中帶回實驗室，置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存備用，共采集21個在中國栽培面積較大品種的葉片（表1）。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹DNA提取 參照鐘淦彬等[8]的方法，采用改良的CTAB法提取橡膠樹幼嫩葉片的總DNA。

1.2.2 PCR反應及電泳檢測 以巴西橡膠樹天然橡膠生物合成（甲羥戊酸途徑）相關的7個基因家族[9]中的目的基因及其啟動子區序列為模板，設計16對引物（表2），由上海生物工程有限公司合成。反應體系：總體積為20 μL，其中正向和反向引物各1 μL（20 μmol/L），10xTrans Taq HiFi Buffer 2 μL，模板DNA 1 μL（50 ng/μL），2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL，HiFi DNA Polymerase 0.5 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。所有材料和引物對進行PCR擴增的反應體系和條件均一致，反應產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結束后，在UVitec凝膠成像系統下觀察拍照。

1.3 數據處理

1.3.1 數據統計與遺傳相似性分析 對PCR反應擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜進行條帶統計分析，根據是否擴增出條帶，轉換為0、1數據，并利用NTSYS軟件構建系統發育樹。

1.3.2 單核苷酸多態性分析 利用SRPP2基因特異引物對云研77-4和南華1號進行PCR反應，將獲得的產物直接進行DNA測序（上海生物工程有限公司），每個樣品至少進行4次PCR產物測序，以保證基因測序結果的準確性，然后用DNAMAN進行序列的拼接，并與GenBank上登錄的SRPP2的cDNA序列（AY237009.1，來自于橡膠樹A775）做多重序列比對，以探測單核苷酸序列的多態性。

2 結果與分析

2.1 特異性PCR產物的多態性分析

本研究共使用25對引物，其中16對引物可在不同樣本中擴增出清晰的條帶（表2和表3）。引物REF1擴增產物經瓊脂糖凝膠的分離結果顯示條帶清晰，無雜質，大小一致，除6、8、9、16號樣本未擴增出條帶，剩余樣本均可擴增出清晰可見的條帶（圖1）。引物SRPP3擴增產物經瓊脂糖凝膠的分離結果顯示條帶清晰，無雜質，大小一致，除9號樣本未擴增出條帶，剩余樣本均可擴出清晰可見的條帶（圖2）。結果表明，16對特異性引物在21份供試材料中共擴增出條帶183條，大小約為1 000～2 000 bp，用同一對引物在不同品種橡膠樹中擴增結果不同，同一個品種用全部引物擴增出的條帶數目也不同，具有一定的擴增多態性，可進一步的統計分析。

2.2 品種間的遺傳相似性分析

數據統計分析結果顯示，利用16對基因特異性引物擴增不同DNA樣本，不同遺傳背景的樣本間具有明顯的差異，同一對引物在不同品種橡膠材料中擴增出的條帶數目變化很大，而條帶大小基本一致，如引物SRPP3能在除RRIC 52外的其余20個品種中擴增出清晰可見的條帶，引物HS1/HS2和SUT5-2只能在PB86中擴增出清晰可見的條帶，在其他品種中均未能擴增出條帶。不同品種樣本利用全部特異性引物擴增出的條帶數目也不同，如PB86用全部引物可擴增出14條條帶，RRIC52用全部引物只能擴增出1條條帶（表3）。利用統計分析出的數據構建系統發育樹，結果表明，大部分品種（除云研77-4和南華1號外）存在PCR擴增產物帶型的差異，可直接通過多個PCR反應，根據擴增條帶的有無加以區分（圖3），但云研77-4和南華1號使用這些引物擴增的結果沒有差異，不能被區分開。

2.3 單核苷酸多態性（SNP）分析

為了準確區分云研77-4和南華1號，利用基因特異性引物SRPP2對云研77-4和南華1號進行PCR反應，獲得的產物直接進行DNA測序，然后利用DNAMAN進行序列的拼接，并與引物SRPP2在GenBank中登陸的cDNA序列（AY237009.1）進行多重序列比對。共考察了SRPP2的3個區域，包括2個內含子區和1個外顯子區，分別定義為Intron1、Exon、Intron2，Intron1（505 bp）中共有33個位點發生堿基突變，Exon（513 bp）中也有6個位點發生堿基突變，3個位點發生堿基缺失，Intron2 （335 bp）中有10個處位點發生堿基突變。總體而言，內含子區域發生的堿基突變位點顯著多于外顯子區域（表4）。根據云研77-4和南華1號在等位基因SRPP2上的單核苷酸多態性，可將二者區分開。

3 討論與結論

目前，中國和東南亞各植膠國的橡膠樹栽培品種主要是由魏克漢從原產地亞馬遜河流域引種的22株野生種質馴化繁衍而成的，遺傳基礎比較狹窄。而中國的自育品種絕大多數又都可追溯到從東南亞引進的少數幾個無性系，如 PR107、RRIM600等，因此中國橡膠樹品種的遺傳基礎更加狹窄[10]。在本研究中21個無性系的相似系數變異范圍僅為0.60～1.00，也證明了這一點。雖然有經驗的研究人員可通過形態學的差異區分不同橡膠樹品種，但不同品種之間的形態學的差異較小，并且受環境因素的影響。從分子水平上對橡膠樹品種進行快速準確的鑒定，能為橡膠樹遺傳育種前期的品種鑒定工作提供幫助，對橡膠樹種質資源的保護、橡膠樹野外品種調查等工作均具有現實的指導意義。

一種理想的作物品種分子鑒定方法應具有以下特點：多態性高；重復性和穩定性好；帶型清晰，容易統計；在染色體上均勻分布；共顯性；簡單快速，易自動化；標準化；開發和使用成本低廉[11-12]。目前報道的同一種作物的品種鑒定多利用PCR技術。因此，適宜的PCR反應體系及其優化利用是作物品種分子鑒定技術的研究內容之一[13-14]。雖然許多傳統的分子標記技術方法均已被用來鑒定不同作物的品種，但在實際操作中，由于DNA用量大，耗費成本高，操作繁瑣，不能簡單快速的區分不同的品種[15-16]。本研究中所采用的鑒定橡膠品種的方法，只需獲得少量的基因組DNA，設計基因特異性引物，進行PCR擴增，利用瓊脂糖電泳檢測及PCR產物測序，最多1周時間就可完成橡膠樹品種的快速鑒定，在本過程中，標準化的PCR反應體系保證了結果的重復性和穩定性，方法操作非常簡單且費用較低，條帶清晰明顯，可靠性高，在大部分的實驗室就能完成。由于本研究選用的是基因特異的PCR擴增，不能從基因組的水平來區分不同品種，同時，少部分品種利用本研究設計的基因特異引物也不能區分，在今后的工作中，可通過增加目標基因的擴增來實現，但同時也可通過對單個基因的序列進行分析，獲得差異化的snp位點，從而達到區分不同品種的目的。

參考文獻

[1] 匡 猛， 楊偉華， 許紅霞，等. 分子標記技術在棉花品種鑒定上的研究進展[J]. 棉花學報， 2009， 21（4）： 330-334.

[2] Wang H， Sun H， Kwon WS， et al. Molecular identification of the Korean ginseng cultivar “Chunpoong” using the mitochondrial nad7 intron 4 region[J]. Mitochondrial DNA，2009， 20（2-3）： 41-45.

[3] Noli E， Teriaca M， Sanguineti M， et al. Utilization of SSR and AFLP markers for the assessment of distinctness in durum wheat[J]. Molecular Breeding， 2008， 22（2）： 301-313.

[4] De Riek J， Everaert I， Esselink D， et al. Assignment tests for variety identification compared to genetic similarity-based methods using experimental datasets from different marker systems in sugar beet[J]. Crop Science， 2007， 47（5）： 1 964-1 974.

[5] Welsh J， Honeycutt R J， Mcclelland M， et al. Parentage determination in maize hybrids using the arbitrarily primed polymerase chain reaction（AP-PCR）[J]. Theoretical & Applied Genetics， 1991， 82（82）： 473-476.

[6] Joshi D， Shrotria P， Singh R， et al. Assessment of RAPD and ISSR marker systems for establishing distinctiveness of forage Sorghum（Sorghum bicolor L. Moench） varieties as additional descriptors for plant variety protection[J]. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding， 2011， 71（1）： 25-36.

[7] Sarao N K， Vikal Y， Singh K， et al. SSR marker-based DNA fingerprinting and cultivar identification of rice（Oryza sativa L.）in Punjab state of India[J]. Plant Genetic Resources，2010， 8（1）： 42-44.

[8] 鐘淦彬， 李維國， 鄭學項， 等. 一種快速高效適于橡膠樹葉片AFLP分析的DNA提取方法[J]. 熱帶農業科學， 2010， 30（5）：1-5.

[9] 鄒 智， 楊禮富， 王真輝，等. 橡膠樹中橡膠的生物合成與調控[J]. 植物生理學通訊， 2009， 59（12）： 1 231-1 238.

[10] 王印肖， 徐秀琴，韓宏偉. 分子標記在品種鑒定中的應用及前景[J]. 河北林業科技， 2006， 34（9）： 46-49.

[11] 焦仁海， 孫發明， 劉興二，等. 玉米DNA分子標記及其研究進展[J]. 中國農學通報， 2006， 22（4）： 48-51.

[12] 李菊芬， 許 玲，馬國歲. 利用分子標記技術鑒定西瓜雜交種純度[J]. 上海農業學報， 2009， 25（1）： 72-75.

[13] 安澤偉， 趙彥宏， 程 漢，等. 橡膠樹EST-SSR標記的開發與應用[J]. 遺傳， 2009， 31（3）： 311-319.

[14] 吳則東， 江 偉，馬龍彪. 分子標記技術在農作物品種鑒定上的研究進展及未來展望[J]. 中國農學通報， 2015， 31（33）：172-176.

[15] 朱巖芳. 農作物品種分子標記鑒定及指紋圖譜構建研究[D]. 杭州： 浙江大學， 2013.

[16] 梁 勇， 李煥秀，何 艷. 幾種DNA分子標記在種子純度鑒定上的應用進展[J]. 廣西農業科學， 2008， 39（1）： 17-20.