中國水仙花瓣類黃酮的提取與HPLC—MSn鑒定方法的建立

柯毅湧 潘騰飛 葉如夢 張蒙 郭志雄 佘文琴 周玉 潘東明

摘 要 以‘中國水仙（Narcissus tazetta L. var. Chinensis Roem）盛花期花瓣為試驗材料，采用高效液相色譜與多級質譜聯用（HPLC-MSn）技術進行鑒定，比較采用2種提取方法（非酸水解法與酸水解法）提取類黃酮物質的優缺點。結果表明：用非酸水解法和酸水解法在盛花期花瓣中共鑒定到了4種黃酮醇類物質，1種酚酸類物質，其中，用非酸水解法首次在中國水仙花瓣中鑒定到了水仙苷，說明該法能在提取過程中避免水仙花瓣類黃酮物質糖苷鍵的斷裂，獲得更豐富的類黃酮物質結構信息，為中國水仙類黃酮物質成分的分析提供參考。

關鍵詞 中國水仙；盛花期；酸水解法；非酸水解法；HPLC-MSn

中圖分類號 S682.21 文獻標識碼 A

Abstract In this study，the petals of‘Narcissus tazetta L. var. chinensis Roemduring full-bloom stage were taken as the experimental materials. The comparison between non-acid hydrolyzation and acid hydrolyzation methods on flavonoids extraction was carried out. High Performance Liquid Chromatography（HPLC） and High Performance Liquid Chromatography-mass spectrometry（HPLC-MSn）techonlogy were employed to compare the advantages and disadvantages of the two extraction methods. The experiment results showed that four flavonols and one phenolic acid were identified in the petals during full-bloom stage by means of non-acid hydrolyzation and acid hydrolyzation. It was the first time that the narcissoside was identified in the petals of Narcissus by means of non-acid hydrolyzation，which indicating that this method could avoid the fracture of glycosidic bond of flavonoids in narcissus petals and obtain more abundant structural information. The results would provide references for analyzing the components of flavonoids in ‘Narcissus tazetta L. var. chinensis Roem.

Key words Narcissus tazetta L. var. chinensis Roem；Full-bloom stage；Acid hydrolyzation；Non-acid hydrolyzation；HPLC-MSn

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.027

花是觀賞植物最主要的觀賞部分，花色是觀賞花卉最直觀的觀賞性狀之一[1]，花色五彩繽紛，其主要由三大類花色素決定：即類黃酮、類胡蘿卜素及與生物堿有關的其它色素，如甜菜堿、小檗堿等[2]。

中國水仙是石蒜科水仙屬多花水仙（Narcissus tazetta）亞屬的多年生草本植物，其花潔白清香，花婷玉立，絢麗多姿，素有“凌波仙子”的美稱，是中國的十大傳統名花之一[3]。中國水仙花色形成主要受類胡蘿卜途徑和類黃酮途徑調控，其中類胡蘿卜途徑是中國水仙黃色副冠花色合成的主要途徑[4]。張慧平[5]研究表明，中國水仙黃色副冠的花色素成分主要是類胡蘿卜途徑中的葉黃素和β-胡蘿卜素，白色花瓣中2種色素含量都很少。在已有的報道中，關于中國水仙花瓣類黃酮途徑的色素成分尚不明確。何炎森[6]使用非酸水解法提取中國水仙盛花期花瓣的類黃酮成分并用高效液相色譜（HPLC）技術進行檢測，得出其主要成分為柚皮苷、蘆丁和綠原酸。羅鵬[7]利用鹽酸、氨水的特征顯色和染色法結合鑒定了中國水仙盛花期白色花瓣的類黃酮成分，得出其主要的黃酮類物質為黃酮和黃酮醇，不含花色素苷或花色素苷的含量極低。

HPLC鑒定方法是將二極管陣列（DAD）檢測器獲得的吸收光譜與標準品進行對照，從而鑒定出類黃酮的化學結構，此法對于已知成分的定性具有一定的優勢[8-10]，但其不能對未知成分的物質進行定性。使用鹽酸、氨水的特征顯色和染色法雖然簡單高效，不過只能對類黃酮物質的類別進行分析，未能做到準確的定性。高效液相色譜與多級質譜聯用法（HPLC-MSn）技術具有樣品消耗量小、靈敏度高、選擇性強、分離和結構確證一次完成等優點[11]，在未知物的定性方面，目前已在甘薯[12]、枇杷[10]、金蓮花[13]、火龍果[14]等植物上有所報道，但使用這種技術識別中國水仙盛花期花瓣的黃酮類成分尚未見報道。本研究擬用HPLC-MSn法鑒定不同提取方法所得的中國水仙白色花瓣的類黃酮成分，為其色素成分的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究試驗材料為中國水仙三年生種球，購于福建漳州龍海市九湖鎮田中央村。于2015年1月取盛花期花瓣用于中國水仙類黃酮成分提取。所有材料均在采后用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2 方法

1.2.1 非酸水解法提取類黃酮 參照陳源[15]的方法提取類黃酮。

1.2.2 酸水解法提取類黃酮 參照Muir等[16]的方法提取類黃酮。

1.2.3 HPLC-MSn檢測類黃酮 HPLC（Agilen1260）檢測條件為：C18色譜柱（Agilent Eclipse Plus， 2.1×100 mm，i.d），柱溫為30 ℃，流動相A為1%乙酸水溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序為：0～2 min，5%B；2～20 min，5%～30%B；20～23 min，30%～95%B。

質譜（6410，Agilent）條件為：電噴霧電離源（ESI），毛細管電壓3.5 kV，離子源溫度350 ℃，干燥器（N2）流速11 L/min，霧化壓力（350 psi，Delta EMV）300 V ，mass 采集 200～1 000 Da，負離子模式。

質譜分析參考文獻[17-19]進行，花色苷類物質在540 nm 下分析，類黃酮類物質在280 nm 下分析。為確定各類物質在紫外-可見光下的吸收特征，對所檢測到的峰在波長 200～540 nm 的物質進行掃描。

2 結果與分析

2.1 非酸水解法提取的中國水仙盛花期花瓣類黃酮成分的鑒定

非酸水解法提取的中國水仙盛花期花瓣類黃酮物質的HPLC總離子流色譜圖見圖1。在負離子模式下，3種酚酸和類黃酮物質在28 min內均得到很好的分離，按保留時間出峰順序先后分別為1號峰、2號峰和3號峰，從峰面積可推測3種物質的含量大小順序為3號峰>2號峰>1號峰。從圖1可以看出，3種物質的峰型和分離度較好，可滿足不同極性的類黃酮物質的分離要求。經DAD檢測可知，3種物質在280 nm和320 nm處均有紫外吸收峰（表1），1號峰物質的出峰時間為6.99 min，一級質荷比為353，二級質荷比為191、85；2號峰物質的出峰時間為13.118 min，一級質荷比為609，二級質荷比為300、271；3號峰物質的出峰時間為14.933 min，一級質荷比為623，二級質荷比為315。根據物質一級質譜母荷離子數據以及二級質譜碎片離子信息，推測1號峰物質為酚酸類的綠原酸，2號、3號峰物質分別為黃酮醇類的蘆丁和水仙苷。

2.2 酸水解法提取的中國水仙盛花期花瓣類黃酮成分的鑒定

酸水解法提取的中國水仙盛花期花瓣類黃酮物質的HPLC總離子流色譜圖見圖2。在與非酸水解法相同的HPLC-MSn檢測條件下，28 min內分離得到了3種酚酸類和類黃酮物質，按保留時間出峰順序先后分別為1號峰、2號峰和3號峰，從峰面積可推測3種物質的含量大小順序為3號峰>2號峰>1號峰。如圖2所示，3種物質的峰型較非酸水解法提取的類黃酮物質好，說明酸水解法提取的類黃酮物質雜質較少，對檢測的干擾小。經DAD檢測可知，3種物質在280 nm和320 nm處均有紫外吸收峰（表2），1號峰物質的出峰時間為6.859 min，一級質荷比為353，二級質荷比為191、85；2號峰物質的出峰時間為19.399 min，一級質荷比為301，二級質荷比為151；3號峰物質的出峰時間為22.662 min，一級質荷比為315，二級質荷比為300。經對比，推測1號峰物質為酚酸類的綠原酸，2號、3號峰物質分別為黃酮醇類的槲皮素和異鼠李素。

3 討論

3.1 不同提取方法所得中國水仙花瓣類黃酮成分的差異

本研究采用非酸水解法和酸水解法提取中國水仙花瓣類黃酮成分，其中的酸水解法被廣泛運用于黃酮苷元化合物的提取。羅美紅等[22]采用酸水解法提取了枇杷葉片的總黃酮成分，得到了黃酮苷元山萘酚和槲皮素。文瑞芝[23]采用萃取-酸水解法分離得到了大豆異黃酮苷元。鄧少東等[24]測定了橘紅中酸水解前后類黃酮成分的變化，酸水解前主要為柚皮苷、野漆樹苷，酸水解后柚皮苷和野漆樹苷分別形成苷元柚皮素和芹菜素。

非酸水解法提取得到黃酮苷已在番茄[16]、刺茉莉[25]、杜鵑[26]中有所報道。由于類黃酮化合物的特性，即可以在多個位置結合多種糖苷，僅幾十種黃酮苷元可形成種類繁多的黃酮苷化合物。將提取得到的黃酮苷化合物經HPLC-MSn技術鑒定可獲得糖苷鍵連接的位置和糖苷的碎片離子等多種信息[19]，有助于研究推斷類黃酮化合物在花色形成過程中的作用。

本研究通過酸水解法提取鑒定得到的槲皮素和異鼠李素分別是非酸水解法提取得到的蘆丁和水仙苷的苷元，說明酸水解能夠使蘆丁和水仙苷的糖苷鍵充分斷裂。通過2種方法的比較，確認了中國水仙花瓣中類黃酮物質在自然狀態下主要是以蘆丁和水仙苷2種形態存在，這與何炎森等[27]通過非酸水解法并利用液相色譜技術（HPLC）在中國水仙盛花期提取鑒定到的2種主要的類黃酮成分（蘆丁、柚皮苷）有所不同，這可能與2種鑒定技術的差異有關，何炎森等[27]采用的HPLC法鑒定類黃酮物質周期長，所測成分單一，需有對照品才能對未知物質進行定性；而本研究采用的高效液相色譜與多級質譜聯用（HPLC-MSn）技術是將高效液相色譜的分離與質譜的選擇性和靈敏性結合起來，尤其是在缺少對照品的情況下能對化合物進行準確的定性分析。

3.2 HPLC-MSn結合ESI和DAD技術在定性苷類物質中有獨特的優勢

觀賞植物花瓣類黃酮物質大部分以苷類的形式存在，由于苷類物質有很大的極性，高溫強酸等劇烈條件下易分解，揮發性不強。質譜作為一種常用的分析手段，在植物類黃酮研究中發揮了重要作用，傳統的電子轟擊質譜（EI-MS）、化學電離質譜（CI-MS）等難以準確地對未衍化的苷類化合物進行定性分析[28]，存在較多的局限性。隨著各種軟電離源（即質譜分析中采用各種離子源把分子解離成離子或碎片）如電離子噴霧（ESI）、大氣壓霧化電離源（APCI）、快源子轟擊源質譜（FAB）等的出現，直接測定黃酮苷類物質成為可能，同時結合多級質譜聯用、二級管陣列檢測器（DAD）的碰撞誘導、捕捉紫外吸收峰等功能，可以獲得豐富的物質結構信息。ESI-MS技術適用于極性大、難揮發的物質，其靈敏度、重現性均優于其它電離源，在糖苷化合物的分析上有明顯的優勢。本研究采用HPLC-MSn結合ESI和DAD技術，分析了經非酸水解法提取得到的中國水仙盛花期花瓣中的類黃酮苷類化合物，得到了其經ESI源轟擊產生的負離子一級質譜母荷信息、二級質譜下的碎片離子信息和其DAD紫外吸收峰范圍。其中2號峰信息與Milbury等[17]、吳子江[29]、李自紅等[30]獲得的蘆丁一級質譜和二級質譜下的碎片離子信息和其DAD紫外吸收峰范圍。其中2號峰信息與Milbury等[17]、吳子江[29]、李自紅等[30]獲得的蘆丁一級質譜和二級質譜的相關信息相吻合，3號峰的相關信息也在Schieber等[31]、Milbury等[17]報道的水仙苷信息中得到驗證，可以推斷2、3號峰物質分別為蘆丁和水仙苷。本研究說明該法在中國水仙花瓣類黃酮苷類物質的定性分析中具有相對準確、可迅速判斷、得到的物質結構信息豐富等優勢，較前人研究中國水仙花瓣類黃酮成分中所采用的HPLC法[27]、顯色法[7]更加精確、高效等。

4 結論

本研究采用了非酸水解法和酸水解法提取中國水仙盛花期花瓣的類黃酮成分，比較了2種方法的優缺點。非酸水解法在提取過程中能夠避免類黃酮物質糖苷鍵的斷裂，能獲取更多的結構信息，因此該方法較適合用于中國水仙花瓣類黃酮物質的提取。此外，本研究首次建立了中國水仙花瓣類黃酮物質的HPLC-MSn鑒定方法，為中國水仙花瓣類黃酮成分的定性提供了參考。

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