油梨組織培養研究進展

羅小燕 申志力 李娟 陳杰忠 趙春香

摘 要 介紹油梨組織培養的國內外研究現狀，包括油梨組織培養的莖尖培養、胚培養、愈傷組織培養和原生質體培養等方法，總結油梨組織培養的條件和目前存在的問題，并提出今后的展望。

關鍵詞 油梨；組織培養；研究進展

中圖分類號 S667.9 文獻標識碼 A

Abstract The advance of avocado tissue culture was introduced， including stem tip culture， embryo culture，callus culture and protoplast culture. Culture conditions and main problems in avocado tissue culture were summarized and the development direction in the future was stated.

Key words Avocado； Tissue culture； Research progress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.030

油梨（Persea americana Mill.）又稱牛油果、樟梨、鱷梨屬于樟科熱帶、亞熱帶常綠喬木，是世界上熱帶亞熱帶著名的水果之一[1]。油梨原產于中美洲及墨西哥濕潤地區，根據其生長的環境，油梨主要分為3個品種群：墨西哥系、西印度系和危地馬拉系[2-7]。而‘Hass油梨品種是目前世界上種植最廣的商業品種，因其穩產、高產、質優而受到栽培者和消費者的歡迎[8]，且以其為主要研究材料進行的相關研究較多[8-12]。油梨營養豐富，富含維生素、蛋白質、脂肪，以及富含鈣、鎂、鈉等礦質元素；并且對人體具有醫療保健作用[13-15]。其種子也富含維生素、蛋白質、脂肪，鈉、鉀等礦質元素；有較高利用價值[16-17]。

近年來我國從國外引進不少油梨品種[10，18]，油梨產業的發展可豐富我國的水果供應。油梨傳統的繁殖方式是實生苗繁殖，而油梨果實單一種子，多胚率不高，繁殖材料難得，繁殖系數低，幼苗生長期長，育苗耗時[19-20]，限制了油梨的種植和產業發展。

油梨的種植和產業發展也受病害等因素的影響，如根腐病、炭疽病、日斑病等[21-23]。在自然界中，很多植物受病害侵染而引起病害，造成生長不良，輕則減產或產品質量下降，重則造成毀種絕收。在生產上很多果樹都是利用嫁接、分株和扦插等無性繁殖來育苗，這些繁殖體會將已經感染的病毒傳染給后代，代代相傳，長期積累，復合感染。而莖尖分生組織培養或者熱處理結合的莖尖培養是脫病毒的主要技術，以組織培養技術為基礎的離體快速繁殖是應用最廣和最有效的一種育苗技術。

植物組織培養是利用植物細胞具有全能性，在無菌的條件下，把離體的植物器官誘導產生愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整植株的一種技術。油梨組織培養技術具有增殖倍數大，培養周期短，繁殖快，可脫除病毒，經濟效益好等優點；近年來發展很快[24]。筆者對近年來國內外研究學者在油梨組織培養方面的研究成果，對油梨的無性系繁殖、無病害苗木培育、種質資源保存和生理生化等方面的研究方法和技術進行了總結，以期為該領域今后的研究提供參考。

1 油梨外植體組織培養

油梨組織培養技術所使用的外植體包括莖段（帶頂芽和腋芽）、合子胚和原生質體等。根據所使用的外植體和培養途徑，油梨組織培養技術可歸類為莖尖培養、胚培養、原生質體培養和愈傷組織誘導等。

1.1 莖尖培養

利用莖尖作為外植體進行組織培養是油梨無病毒苗的培育方法之一，可以快速繁殖大量的優良苗木[25]。離體條件下木本植物不定芽的誘導主要受到基因型、外植體來源和培養基中不同激素配比的影響[25]。木本果樹的老熟枝條作外植體通常攜帶病菌較多，初分化和再分化難，嚴重影響組織培養的成功率；因而，油梨莖尖培養多以成年油梨樹的半木質化嫩枝條或幼胚苗的莖尖作為外植體進行培養。

Schaffer等[26]認為利用幼嫩莖段為外植體進行培養時N元素的形式和濃度對其誘導和增殖效果影響顯著；同時指出培養環境中CO2的濃度對其有一定影響。梁日高等[27]利用7年生的油梨莖段為外植體發現最適宜的誘導培養基為1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30 g/L白糖+6 g/L卡拉膠（kappa-Carrageenan）（1/2 MS指MS培養基中的大量元素減半），最適宜的增殖培養基是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30 g/L白糖+6 g/L卡拉膠；最適宜的生根培養基是1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+30 g/L白糖+6 g/L卡拉膠（1/2 MS指MS培養基中的大量元素減半）。且指出可用自來水代替無菌水，白砂糖代替分析純蔗糖，卡拉膠代替瓊脂粉。Barrera-Guerra等[28]利用嫩枝的莖段和幼苗的莖段段作為外植體在MS培養基中進行誘導、增殖和生根培養；并且在培養基中添加四環素（Tetracyclines）、慶大霉素（Gentamicin）、利福平（Rifampicin）等抗生素以更加徹底地滅菌和減少污染，結果發現油梨莖尖培養的周期更長，生根率更低。Vega[29]認為西印度系的the‘Colin V-33油梨品種的莖尖培養誘導率成功較高，并且提出6-BA和GA3對莖尖培養影響較大。一般認為，采用不同部位（上、中、下）的莖段作外植體時其誘導率不同，如以‘Nauclea diderrichii幼苗枝條上端的莖段為外植體時其誘導效果最佳[30]；而針對油梨不同部位莖段誘導效果則有待做進一步的探討。

許多研究表明利用油梨莖段為外植體， 其污染率較大， 原因主要是難以獲得無菌外植體。而利用油梨實生幼胚苗的莖段，生長勢較旺盛，帶菌較少，是油梨莖尖組織培養的優良材料。

1.2 胚培養

油梨果實具單一種子，多胚率不高，合子胚（由植物的雌雄配子融合形成的合子繼而發育形成的有性胚）往往只有一個。在油梨果實的整個發育過程中其幼果不斷脫落，果實接近成熟時其種胚才能存活；若不采取種胚離體培養，就會降低油梨育種工作的效率[31]。油梨種胚組織培養分為未成熟胚和成熟胚組織培養。油梨種胚培養有助于克服雜交育種中合子胚退化或敗育性等問題，種胚培養技術的發展推動油梨育種工作的進行。目前較多的報道是利用未成熟的合子胚作為外植體，通過合子胚的早期離體培養能夠獲得雜種后代；在油梨優良種質保存以及防止種質退化等方面有較大的應用價值[32]。較多的學者利用合子胚為外植體進行油梨完整植株誘導，并結合離體低溫保存技術進行種質保存技術研究。

一般認為胚齡是影響油梨幼胚培養成功的關鍵因素之一。Sken等[31]利用不同胚齡的油梨種胚作為外植體，研究發現油梨極幼小的種胚在各種的培養基中基本不能生長，在培養基中添加生長調節劑效果不明顯；只有6～7周齡或以上的胚才能大量存活且在培養基中添加植物生長調節劑其生長速度加快。Rohim等[11]以‘Hass油梨品種種胚為外植體，發現胚齡是影響胚培養的重要因素，胚齡越小其誘導率越低；胚齡在180～210 d的合子胚誘導率達100%。因為油梨極幼小的種胚在各種培養基中基本不能生長，只有6～7周齡或以上的胚才能大量存活。利用油梨未成熟合子胚來誘導形成體細胞胚胎并在合適的條件下進行“胚性生長”，從而進行正常的胚胎發育并完成其胚胎發育過程后誘導形成苗[33-34]。一般，油梨合子胚培養較多采用MS（Murashige Skoog）培養基，也有研究者采用B5、1/2 MS等培養基。由于幼胚生長在一個高滲透壓環境下，離體培養時需要高鹽濃度培養基；需要增加蔗糖的濃度[35]。為了探討蔗糖濃度、凝膠劑濃度和培養基類型等對油梨幼胚培養的影響，Witjaksono Litz等[36]利用油梨未成熟合子胚為外植體，發現在MS培養基中培養效果最佳，且添加6～7 g/L凝膠劑和30 g/L蔗糖效果最佳。同時，在油梨胚培養中為改善其生長環境除了使用蔗糖外，也有采用脯氨酸（Proline）、谷氨酸鹽（Glutamic acid）等作氮源以增加培養基的銨態氮濃度。Encina等[37]應用二步培養法（在固體、液體培養基交替培養）進行胚培養，添加脯氨酸和谷氨酸鹽改善其誘導效果。Raharjo等[20]利用‘Hass油梨品種未成熟合子胚作外植體，其研究發現在體細胞胚胎誘導和增殖培養階段添加肌醇（Inositol）、毒秀錠（Picloram）和硫胺素鹽酸（Thiamine hydrochloride）等物質有利于促進培養物的生長。

溫度和光照條件也是影響胚培養的因素之一，不同果樹品種對溫光的要求各不相同。對于油梨種胚組織培養較多的研究學者認為（25±1）℃較合適[34，36-39]，也有人認為在27 ℃較適宜[20]。在油梨合子胚培養過程中有的采用光培養，有的采用暗培養，也有人進行光暗交替培養。Márquez-Martín等[38]利用光暗交替培養技術提高油梨合子胚誘導率。

油梨合子胚培養利于克服胚退化和種胚敗育性等問題，提高育種工作的效率。但油梨合子胚培養，會出現單極生長（只有莖段生長或根生長），頂端或節點容易壞死等現象[40]。油梨胚胎培養物會隨著時間的延長和形態的改變失去其胚胎的完整性；依據品種的不同，一般在誘導培養3個月之后出現此現象[34]。出現兩極生長（莖段和根正常生長）現象的概率大概是0.002%～5%或6%，其概率的大小依品種而異[41]。為解決這一問題Raharjo[11]結合微芽嫁接技術培育完整油梨植株，以‘Hass、‘Booth-7、‘Lima Late、‘Lula和‘Waldin4個品種的油梨未成熟合子胚培養發育形成的莖段或由莖尖誘導培養形成的莖段為接穗，以‘Bernecker油梨品種實生苗為砧木進行嫁接。發現嫁接后的成活率達59%～100%，頂端嫁接和腹嫁接的成活率達68%～72%；且在嫁接后20～25 d開始生長，其成活率可達52%～76%。

油梨種胚培養技術有利于培育無病毒苗木，Sánchez-Romero等[42]提倡油梨育種工作中應廣泛使用合子胚誘導技術；因為未成熟油梨種胚是優良的外植體，因其污染率較小、取材較方便和誘導成功率較大。不同油梨品種發育程度不同的合子胚，對培養條件的要求不同，這有待研究者進一步探討。

1.3 愈傷組織培養

為了獲得最佳的油梨組培材料，有人利用莖段或葉子為外植體并結合愈傷組織誘導技術來培育完整的油梨植株。Young等[43]利用‘Lula和‘Waldin油梨品種實生苗的葉子、腋芽和莖段作為外植體來誘導愈傷組織。發現油梨葉片的存活率和愈傷組織的誘導率可通過選擇適當部位的外植體和調整其在培養基中的放置位置來優化， 合適的培養溫度和適當使用生長激素可增強愈傷組織的誘導；適當使用GA3和提高培養的溫度可促進腋芽的伸長。在光照條件下和使用1.0 mg/L BA可以促進愈傷組織分化出芽；但是，利用油梨葉片誘導愈傷組織時間周期長，成功誘導率也較低，而利用接近葉腋部位的葉柄和帶腋芽的莖段效果較好。

彭民璋等[44]以‘Hass油梨品種的種胚為外植體，誘導形成愈傷組織作為保存材料并研究采用冷藏（8 ℃）、利用多效唑延長繼代時間、減少繼代次數等方法；發現低溫（8 ℃）保存，貯存時間長約6個月時愈傷組織依然具有再分化能力。用0.4 mg/L多效唑對油梨愈傷組織進行處理，愈傷組織保存8個月后依然具有較強的脫氫酶活性和較高的植株再生頻率。Guzma′n-Garc1′a等[45]使用緩慢冷卻法和熔滴玻璃化法，發現用熔滴玻璃化法處理60 min油梨種胚的再生恢復能力可達77.78%～100%；同時指出原始材料是種質離體低溫保存的關鍵且胚性愈傷組織和體細胞胚在融化之后依然會保持較高的再生能力。進行離體低溫種質保存的好處在于：（1）利于保存從作物改良研究中發現的優良胚系，（2）備份異地種質庫[41]。在國內外曾有研究者利用離體低溫保存技術解決此問題， 油梨種質離體低溫保存對于油梨種質的保存和培育優良品系種群具有重要作用。此外，研究油梨種質離體低溫保存技術，有利于發展培育優良無病害的植株建立優質油梨種質資源庫。

1.4 原生質體培養

在國外利用油梨原生質體作為外植體誘導，培育油梨完整植株也有相關報道。植物原生質體在適宜的條件下具有再生成與其親本相近個體的全能性，可經離體培養得到再生植株。借助原生質體培養及誘導融合技術可獲得雜種和多倍體植株， 可有效克服植物有性雜交不親和現象；利于提高果實產量，改善果實品質，培育新品種[46]。

原生質體再生實驗已在蕓香科[47]和薔薇科的蘋果[48]、酸櫻桃[49]和梨子[50]得到應用。利用油梨未成熟合子胚進行原生質體的分離和培養也有報道。Grosser等[51]利用‘T362油梨品種未成熟合子胚和珠心胚作為外植體通過原生質體分離提純、培養、誘導愈傷和再生植株；發現培養基類型、培養基濃度、培植的密度等對原生質體培養影響顯著，以MS培養基效果較好。研究認為影響原生質體培養的因素主要有植物基因型、原生質體的栽植密度、培養基類型和激素等[46]。

原生質體培養技術要求較高，難度大，而且在我國油梨原生質體培養少有報道。目前還需要經過探索和研究，進一步形成和完善適合不同油梨基因型的高效培養體系，以縮短原生質體培養的周期和促進育種工作的進行。

1.5 培養條件和培養基

油梨組織培養過程中，溫度、光照和pH等環境因子對組織培養有顯著影響。研究認為，油梨組織培養的最佳溫度為（25±1）℃，光照強度為2 000～3 000 lx，光照時數為10～16 h/d，pH為5.7～6.0，蔗糖的濃度為25～45 g/L，以30 g/L效果最佳，凝膠劑多使用瓊脂粉[11，20，26-30，34，36-39，44，4，52-53]。但是，Raharjo等[20]把油梨組織培養物放于（27±1）℃環境下，發現培養效果更好。Pitekelabou等[30]認為把培養物置于（27±2）℃環境下，培養效果也較好。

培養基類型也是油梨組織培養的重要影響因子之一，大部分學者以MS、1/2 MS和B5為基本培養基[27-28]；也有人以WPM、改良MS（大量元素減半）為基本培養基[27，30]。為探討培養基類型對組織培養的影響，Rohim等[11]以‘Hass油梨品種合子胚為外植體，以MS和B5為基本培養基，發現MS培養基培養效果最佳。總的來說，在油梨組織培養中，供試品種及其外植體類型不同，不同的培養基類型和培養條件產生的影響不同，效果最佳的為MS培養基。

2 存在的問題

2.1 污染

組織培養過程中造成的污染可分為外源性污染和內源性污染， 外源性污染只要操作嚴格要求，環境條件嚴格控制，一般可以控制；而內源性污染是最難控制的污染源，主要從外植體的選取以及外植體的消毒等方面控制[54]。同時，造成污染的病原主要分為細菌和真菌，細菌污染在接種1～3 d后就可被發現；真菌污染的特點是污染部分長有不同顏色的霉菌，在接種3～15 d后才可被發現[55]，在接種后兩周左右才可判斷外植體能否正常生長；而常用的消毒劑有次氯酸鈉、漂白水、氯化汞[56]。

若污染菌類是從材料周圍長起，則可判定為植物材料自身帶菌引起；也有可能是接種時材料被污染，接種工具滅菌不徹底導致。如果污染菌類是從培養基以上部分長起，不是在培養基長起，同時在接種5 d后發現，就可判定污染是油梨外植體本身的內生菌導致。如果污染菌類是零星分散于培養基中，就可確定為人為造成的污染；比如接種用具、培養基滅菌不徹底，接種員操作不正確，開瓶時間太長，操作中心在人體范圍內；培養室環境不干凈等。如果污染是從培養基以下部分開始生長， 且有從里向外發展的趨勢， 就說明是切口引起的污染，原因可能是外植體滅菌之后沒有剪去切口；或雖剪去，但器具本身帶菌[56]。

為減少油梨組織培養過程中產生的污染，一般采用污染較少且生長旺盛的植物部位作為外植體，很多學者采用未成熟的合子胚、幼胚芽等為外植體[11，20，26-30，33-34，36-40，53]。Barrera-Guerra等[28]利用嫩枝莖段和幼胚芽為外植體，并提出在培養基中添加四環素、慶大霉素、利福平等抗生素可減少污染。值得注意的是使用抗生素雖有一定的殺菌效果，但是并不是對每一種菌種都有效[56]。同時抗生素在不穩定的環境下易分解而失去其活性，而且使用濃度不對也會對外植體產生負面影響；因此尋找適宜的抗生素已成為重要的課題。

針對不同污染情況有不同的解決方法，主要采取4個方面的措施：一是外植體的選擇，選擇帶菌少的外植體。二是選擇適當的消毒方法，常見的消毒劑有次氯酸鈉、乙醇、氯化汞、過氧化氫等。三是對接種室進行空間滅毒。最后是操作人員嚴格按照無菌操作規則進行操作。

2.2 褐化

油梨為木本植物，次生代謝旺盛，植物體內含有較多的酚類和醌類化合物，這些褐色物質在培養基中不斷擴散積累，抑制其他酶類的活性，毒害培養材料，嚴重地影響整個組織培養過程。實驗研究認為，外植體的生理狀態和部位、取材時間和大小、受傷程度及所用消毒劑等對褐化有一定程度的影響[57]。謝志亮等[58]指出外植體材料（包括外植體取材時間、外植體大小、外植體部位和種類、外植體消毒時間等）、培養基和培養條件對褐化有一定影響；同時，可通過選擇適宜的外植體、預處理材料、選用適宜的培養基和培養條件、使用防褐劑和連續轉移外植體來減少褐化。在油梨組織培養中常用的方法是在培養基中添加防褐化劑如活性炭、硝酸銀、PVPP（Crosslinking polyvingypyrrolidone）和維生素C（Vitamin C）[59-60]。Encina等[37]以活性炭為添加劑，使得外植體生長狀態更佳，褐化率減少。使用活性炭在一定程度上可減少褐化，但使用時要注意控制濃度和使用的時間，否則會對外植體產生不良效果。

雖然一定濃度的防褐化劑可在一定程度上減輕褐化對培養物的影響，但對于一些褐化嚴重的植物則效果不明顯。所以，要從根本上解決此問題就要從褐化產生的生理及分子機理深入探討。

2.3 組培苗生根難度大

組培苗的生根過程是一個復雜的生理生化過程， 一般影響外植體不定根的因素主要有外植體基因型、培養基類型、取材部位、植物生長調節劑、培養條件等[61]。油梨組培苗生根難度大主要表現在生根概率低，一些品種難以獲得完整植株，出現單極生長現象。

油梨合子胚培養再生繁殖形成兩極生長的完整植株的概率大概是0.002%～6%，其概率大小依品種而異[52]。Barrera-Guerra等[28]利用莖段為外植體培養在生根階段嘗試了各種處理，發現其生根的概率為0～20%。Encina等[37]為解決此問題嘗試二步培養法（固態培養基-液態培養基-固態培養基）使得生根率增加到35%～58.3%。油梨是木本植物，其在組培過程中生根較困難，可通過使用不同濃度的IBA和體外微芽嫁接來促進生根，同時注意觀察幼苗的生長情況，Barrera-Guerra等[28]，在外植體培養期間，發現根的形成和生長較難且嫩枝生長較慢。Raharjo等[52]結合微芽嫁接技術來培育完整油梨植株，以組培苗的莖段為接穗，以油梨幼苗為砧木；結果形成完整植株且成活的概率達52%～76%。

油梨生根培養存在一定的難度， 同時也是整個組織培養過程成功的關鍵部分之一。因此，誘導帶有高質量根系的組培苗是亟待解決的問題。

2.4 移栽成活率不穩定

油梨組培苗移栽成活率不高，一是組培苗移栽階段感病嚴重而加大死亡率，二是組培苗在移栽過程中易斷根。因此，要提高不定根質量和組培苗適應環境的能力，提高移栽成活率，才能為實現油梨產業化發展奠定基礎。Martínez-Ferri等[62]在油梨植物生產育苗階段引入菌根劑和施加雞糞，發現對油梨植株的生長有積極影響。為提高油梨組培苗的移栽成活率，在移栽前可對組培苗進行煉苗和優化移栽基質；同時密切觀察組培苗的長勢。

3 展望

植物組織培養技術的發展在生物科學研究和應用中發揮重要作用，也在油梨的栽培與生產上得到廣泛的應用與研究。通過莖尖培養繁殖無病毒植株，利用胚培養誘導未成熟種胚的發育與成長；借助離體低溫冷凍保存技術保存優良油梨種質和選擇優質油梨品種。油梨離體培養技術的迅速發展和不斷完善，將會大大提高油梨的育種效率，加快油梨品種改良和油梨產業化的進程。

針對油梨組織培養存在的問題，目前我國學者研究甚少，為此我國的研究學者應加大力度重視油梨組織培養的技術研究體系；形成針對不同品種的實用、高效、標準的組培快繁體系。結合基因工程技術培育高產、優質、營養價值高、無病害、樹體矮化、樹形優美的油梨新品種；滿足人民日益增長的需求。

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