農桿菌介導的蘆筍遺傳轉化體系的建立

鹿志偉 侯曉婉 高建明 張燕梅 楊子平 陸軍迎 李俊峰 趙艷龍 周文釗 易克賢

摘 要 以蘆筍“井崗701”胚狀體為試驗材料，在構建pCAMBIA3300-35S-hevein-NOS植物表達載體基礎上，采用農桿菌介導的轉基因方法，探究菌液濃度、AS濃度、侵染時間和共培養時間等4個因素對蘆筍轉基因效率的影響，以期建立高效的蘆筍轉基因體系。結果表明：用菌液濃度OD600=0.6，AS終濃度為200 μmol/L的農桿菌菌液進行侵染，侵染10 min后，暗培養4 d的轉基因效率最佳，經PCR檢測，陽性轉化率達21%，獲得了轉基因幼苗。本實驗構建了完整的農桿菌介導的蘆筍遺傳轉化體系。

關鍵詞 蘆筍；農桿菌介導；遺傳轉化體系

中圖分類號 S644.6 文獻標識碼 A

Abstract Embryoids derived from asparagus“Jinggang 701”were chosen as the experimental materials. With construction of plant expression vector-pCAMBIA3300-35S-hevein-NOS， the effects of liquid bacterial concentration， AS concentration， infection time and co-culture time on asparagus transgenic efficiency were explored by the agrobacterium-mediated transgenic method. The high-efficiency transgenic system of asparagus was expected to be established in this study. The result showed that the optimal infection conditions were liquid bacterial concentration OD600=0.6， adding AS up to final concentration of 200 μmol/L， infecting for 10min and culturing under darkness for 4 d， which made the transformation rate up to 21% and got transgenic plant.

Key words Asparagus（Asparagus officinalis L.）；Agrobacterium-mediated；Genetic transformation system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.009

蘆筍（Asparagus officinalis L.）屬于天門冬屬的多年生草本植物，在歐洲、亞洲、澳大利亞以及美洲的分布尤為廣泛，中國是蘆筍的主要生產國之一[1]。蘆筍除了具有重要的食用價值外，還對多種疾病具有良好的治療效果，如降血糖、抗癌等，享有“蔬菜之王”的美譽[2-4]。當前市場上流行的蘆筍品種雖然高產但是均易感病，尤其是莖枯病嚴重影響著蘆筍的產量，高產、抗病蘆筍新品種的選育已成為當務之急。新品種選育主要有雜交育種和轉基因育種2種方式，雜交育種的隨機性、過程繁瑣、育種周期長等特征致使新品種培育具有很大的不可控性，短期內難以得到抗病高產的蘆筍新品種。而轉基因育種則不同，其可以對植株性狀進行定向的改變，品種選育周期短、可控性高，日益成為品種選育的首選方式。

Hevein基因又稱為橡膠樹凝集因子基因，其表達產生的橡膠樹凝集因子是一個富含Cys和Gly的小分子單鏈蛋白質，具有結合幾丁質的作用，是乳膠中橡膠粒子凝集的主要影響因素，也是乳膠中黃色物質的主要蛋白質之一[5]。后來從甜菜葉片、小麥等植物種子中也發現了類似的hevein-like蛋白，經研究發現hevein和hevein-like蛋白在植物體內和體外還表現出廣譜的抗菌性，對細菌、真菌等病原菌都具有良好的抑菌性能[6-8]。

目前，國內外有關蘆筍轉基因育種的相關研究較少，在國內尚未有相關報道，而國外僅3人對蘆筍轉基因有過報道：Hernalsteens等[9]將空的根癌農桿菌轉入蘆筍莖中，并成功地在轉化植株中檢測到胭脂堿和農桿菌素堿，證明根癌農桿菌成功地轉入了蘆筍中。Bytebier等[10]將含有NOS-APHⅡ基因的根癌農桿菌成功轉入蘆筍中；Limanton-Grevet等[11]將含有uidA和nptⅡ基因農桿菌AGL1成功轉入蘆筍胚性系中，并對后代進行了遺傳分析。雖然研究人員已成功將外源基因轉入蘆筍植株中，但是轉化體系中轉化率均較為低下，轉化周期長，且均無目的基因轉入。筆者在前人研究的基礎上，以蘆筍胚狀體作為外植體，在構建含有35S-hevein-NOS表達元件的pCAMBIA3300植物表達載體基礎上，探究菌液濃度、AS濃度、侵染時間和共培養時間等4個因素對農桿菌介導的蘆筍轉基因效率的影響，以期進一步完善農桿菌介導的蘆筍遺傳轉化體系，提高遺傳轉化率，并導入目的基因，為后期蘆筍轉基因抗病高產新品種選育奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

植物表達載體：pBI121、pCAMBIA3300，均由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所張樹珍實驗室惠贈。農桿菌EHA105菌株和Puc57-hevein由本實驗室保存。限制性內切酶均為fermentas公司產品，DNA聚合酶和連接酶為NEB公司產品，其它分析純藥品及試劑盒。蘆筍“井崗701”購自江西省農業科學院。

1.2 方法

1.2.1 外植體制備 外植體制備方法參照鹿志偉等[12]的研究方法。

1.2.2 植物表達載體構建 設計5′TGCTCTAGAAT

GAAATACTGTACTATGTTTAT3′（添加XbaⅠ酶切位點）和5′CGAGCTCTCAGTTGGCACCGC3′（添加SacⅠ酶切位點）引物對hevein基因進行擴增，隨后對擴增得到的目的片段進行電泳檢測。準確無誤后，對擴增得到的目的基因和pBI121進行XbaⅠ和SacⅠ雙酶切，分別使用PCR產物回收試劑盒和膠回收試劑盒對二者進行目的片段回收，將回收得到的目的基因和pBI121大片段進行T4 DNA連接酶連接，獲得含hevein基因的pBI121載體（圖1）。隨后分別對改造后的pBI121載體和pCAMBIA3300進行HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，使用膠回收試劑盒對pBI121進行小片段回收，而對pCAMBIA3300則進行大片段回收，對得到的2個片段進行T4 DNA連接酶連接，從而完成含有35S-hevein-NOS基因表達元件的pCAMBIA3300植物表達載體構建（圖2），最后采用凍融法將構建好的植物表達載體轉入農桿菌EHA105中，-20 ℃備用。

1.2.3 蘆筍胚狀體對PPT的抗性實驗 將蘆筍胚狀體切成0.6 cm2大小，添加至含0、5、10、20、40、80 mg/L PPT的轉化培養基中，每組實驗添加20塊外植體，重復3次，培養20 d后，觀察蘆筍胚狀體生長狀況并統計死亡率。

1.2.4 預培養 將培養好的蘆筍胚狀體切成0.6 cm2左右的小塊，置于預培養基上，26 ℃光培養2 d。預培養培養基：MS+4%蔗糖+800 mg/L谷氨酰胺+500 mg/L酸水解酪素+0.70 mg/L嘧啶醇+0.10 mg/L NAA+0.50 mg/L kinetin，pH5.8。

1.2.5 轉化菌液的制備 取-70 ℃保存含pCAMBI

A3300-35S-Hevein-NOS質粒的轉化農桿菌菌液20 μL，置于YEP固體培養基（含Kanamycin 50 mg/L和Rifampicin100 mg/L）中，涂布均勻。靜置30 min，28 ℃倒置培養2 d。挑取單菌落接種至含Kanamycin 50 mg/L和Rifampicin 100 mg/L 的YEP液體培養基中，28 ℃、250 r/min震蕩培養直至對數期（OD600約為0.55左右），5 500 r/min，-4 ℃離心8 min，收集菌體，液體轉化培養基懸浮。

1.2.6 侵染和共培養 使用液體轉化培養基將上述菌體OD600值分別調節為0.2、0.4、0.6、0.8。將預培養2d蘆筍胚狀體置于150 mL無菌錐形瓶中，同時錐形瓶中添加50 mL含轉化農桿菌菌體和乙酰丁香酮（濃度分別為0、50、100、200 μmol/L）的液體轉化培養基，從而對胚狀體進行農桿菌侵染，侵染時間為5、10、20、40 min，26 ℃ 150 r/min振蕩。無菌濾紙擦干蘆筍胚狀體表面液體，轉移至固體轉化培養基中，26 ℃，暗培養2、4、6、8 d。

1.2.7 脫菌與選擇培養 使用200 mg/L Timentin對共培養后的蘆筍胚狀體進行脫菌10 min，100 r/min輕輕振蕩，然后無菌水清洗3次。重復3次。無菌濾紙擦干蘆筍胚狀體表面液體。最后轉移至含Timentin和PPT的固體轉化培養基中，26 ℃，光培養，直至原有胚狀體表面有新的胚狀體生成，上述每組實驗添加80塊胚狀體，重復3次，統計抗性胚狀體轉化率，抗性胚狀體轉化率/%=抗性胚狀體個數/胚狀體處理總個數×100。

1.2.8 分子水平檢測 PCR檢測是一種非常簡單、快速和直接的轉基因苗檢測方法，本實驗用此方法對抗性胚狀體進行檢測。胚狀體經PPT篩選后進行PCR驗證以及植株再生。采用OMEGA植物DNA提取試劑盒對抗性胚狀體進行DNA提取，并進行PCR檢測，統計陽性轉化率。

1.2.9 抗性植株再生 將選擇培養后新長出的胚狀體轉移到生苗培養基中，進行苗誘導。

1.3 數據分析

使用SPSS19.0和Excel2007軟件對試驗數據進行統計分析[13-14]。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體構建

2.1.1 pBI121-Hevein載體的構建 對pBI121-hevein植物表達載體進行PCR擴增以及電泳分析，發現有且僅有一條約276 bp目的基因條帶，與目的基因hevein相符（圖3）。

2.1.2 植物表達載體pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS的構建 對pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS植物表達載體進行雙酶切以及電泳分析，發現經雙酶切后載體被分為2個片段，其中小片段大小為1 100 bp左右，與目的基因表達元件35S-Hevein-NOS相符（圖4）。

2.1.3 植物表達載體pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS轉化農桿菌及其驗證 對pCAMBIA3300-35S-Hevein-NOS植物表達載體進行菌落PCR驗證，發現在PCR目的條帶大小為1 100 bp左右，與目的基因表達元件35S-Hevein-NOS相符（圖5）。

2.2 蘆筍胚狀體對PPT抗性的研究

由表1和圖6可以看出，隨著PPT濃度的增加，蘆筍胚狀體發生萎縮、變黃直至死亡，死亡率逐漸增加，PPT濃度為20 mg/L時胚狀體全部死亡。

2.3 不同農桿菌菌液濃度和侵染時間對蘆筍遺傳轉化的影響

由表2可知，不同菌體濃度對抗性胚狀體的轉化率存在顯著性差異（p<0.05），當菌體濃度為0.6時，轉化率最高。由表3可知，不同侵染時間對抗性胚狀體的轉化率不存在顯著性差異（p<0.05），為達到侵染時間最短以及轉化率較高的目標，侵染時間選擇10 min為佳。因此，農桿菌菌液濃度OD600=0.6，侵染時間10 min時為最佳作用條件。

2.4 不同共培養時間對蘆筍遺傳轉化的影響

由表4可知，當共培養時間為4 d和6 d時，抗性胚狀體轉化率與其它處理相比差異顯著，轉化率分別為15.0%和14.0%。為了節省培養時間，同時又使轉化率達到最高，共培養時間選擇4 d為佳。

2.5 不同濃度AS對蘆筍遺傳轉化的影響

由表5可知，不同AS濃度對抗性胚狀體轉化率存在顯著性差異（p<0.05）。當AS濃度為100、200 μmoL/L時，抗性胚狀體轉化率與其它處理相比差異顯著，轉化率分別為16.0%和20.0%。為了使轉化率達到最高，AS添加濃度選擇200 μmoL/L作為最佳。

2.6 轉基因植株的PCR檢測

由圖7可知，陽性對照和再生蘆筍植株PCR結果中目的條帶大小一致，約為1 100 bp，大小與基因表達元件35S-Hevein-NOS相符。整個轉基因過程見圖8。

3 討論與結論

農桿菌介導的植物遺傳轉化是一個非常復雜的過程，受外植體類型、菌液濃度、菌株類型、侵染時間、共培養時間、以及乙酰丁香酮濃度等多種因素影響，而且不同植物基因型、外植體其對應的農桿菌最佳侵染條件不同，轉化率也具有很大差異。農桿菌作為轉化效果最好的植物轉化方式之一，目前為止已有很多相關研究，如周月等[15]通過農桿菌介導法將LJAMP2基因成功導入“紅陽”泥猴桃中，其使用的最佳農桿菌侵染條件為：共培養時間為2 d，農桿菌菌液濃度為OD600=0.5，侵染時間為10 min，AS濃度為100 μmol/L，轉化率達到5.11%；Gnasekaran等[16]農桿菌介導的蘭花轉基因中，最佳的農桿菌侵染條件為：OD600=0.8，侵染時間30 min，共培養4 d，AS濃度為200 μmol/L，轉化率高達33.6%。

農桿菌介導的蘆筍遺傳轉化體系的研究已有部分工作，如Bytebier等[17]使用愈傷組織作為外植體，經過侵染、選擇培養以及植株再生等得到了轉基因蘆筍植株，但是轉化周期較長。Bruno等[18]使用C58農桿菌菌株，同時對3個基因型的蘆筍體細胞進行轉化，檢測得到陽性植株，但是轉化率較低，為0.6%～4%。Limanton-Grevet等[19]使用AGL1Gin農桿菌菌株，選用5個胚性系作為侵染對象，結果發現轉化率為0.8%～12.8%，轉化率得到提高。本研究在綜合對比分析前人研究的基礎上，以蘆筍胚狀體作為侵染對象，采用EHA105農桿菌菌株，并對菌體濃度、侵染時間、共培養時間等侵染條件進行優化。結果表明，蘆筍轉化率大大提高，最高可達21%。轉化周期得到有效地縮短，遺傳效率得到極大地提高。另外，實驗中成功將hevein基因和bar基因轉入蘆筍植株中，有利于后期抗病、抗除草劑蘆筍新品種的選育。

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