松墨天牛葡萄糖—6—磷酸異構酶基因克隆及序列分析

蔡紫玲　陳敬祥　林同

摘要：【目的】克隆松墨天牛（Monochamus alteratus）葡萄糖-6-磷酸異構酶（GPI）基因cDNA序列，探究其分子特征，為深入研究松墨天牛GPI的分子功能打下基礎?！痉椒ā坎捎肦ACE技術克隆松墨天牛GPI基因cDNA序列，并對該序列及其編碼氨基酸序列進行生物信息學分析。【結果】克隆并鑒定松墨天牛GPI基因，命名為MaGPI（GenBank登錄號：KU323592），該基因序列長1038 bp，共編碼279個氨基酸。同源比對分析發現，松墨天牛與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）的同源性最高，達90%，而與其他昆蟲的同源性在76%以上。系統發育進化樹分析結果表明，松墨天牛與赤擬谷盜在同一分支，與家蠶（Bombyx mori）相隔最遠。MaGPI為親水蛋白，含有5個功能位點：活性位點、變構位點、活性部位蓋子和兩個多肽結合位點?！窘Y論】明確了MaGPI的核苷酸序列及編碼蛋白特征，為進一步研究MaGPI的分子功能提供依據。

關鍵詞： 松墨天牛；葡萄糖-6-磷酸異構酶；克隆；生物信息學

中圖分類號： Q966 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）05-0657-05

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to clone full-length cDNA of glucose-6-phosphate isomerase（GPI） from Monochamus alteratus， and analyze its molecular characteristics， in order to lay the foundation for further studying its functions. 【Method】The cDNA of GPI gene was cloned from M. alteratus using RACE technology. The gene sequcence and its amino acid sequence were analysed using bioinformatics softwares. 【Result】The GPI gene was cloned successfully from M. alteratus， and named MaGPI（GenBank accession no. KU323592）. Its cDNA was 1038 bp in length， encoding 279 amino acids. The alignment of amino acid sequences showed that， MaGPI shared the highest homology（90%） with GPI gene of Tribolium castaneum， and shared homology of 76% with other insects. The phylogenetic tree showed that M. alteratus and T. castaneum was in the same branch， and far from Bombyx mori. MaGPI was a hydrophilic protein， with 5 functional sites viz.， active site， allosteric site， cap of active site， peptide binding site. 【Conclusion】The sequence of nucleotide and characteristics of amino acid sequence encoded by MaGPI gene have been clarified， in order to provide a foundation for further researching molecular function of MaGPI.

Key words： Monochamus alteratus； glucose-6-phosphate isomerase； clone； bioinformatics

0 引言

【研究意義】松墨天牛（Monochamus alteratus）是毀滅性松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）病的主要媒介昆蟲和森林蛀干害蟲（Togashi，1989），寄主多為松屬（Pinus）植物（楊建霞等，2009），主要危害衰弱、瀕死及新伐的樹木。自松墨天牛傳入我國以來，目前在江蘇、浙江、福建、安徽、臺灣和香港等地區均有分布（張鍇等，2010），國外分布于日本、朝鮮、老撾等國（楊寶君等，2003）。我國自1982年發現松材線蟲病后（楊寶君等，2003）便一直致力于該病的防治，其防治除殺死宿主松墨天牛外并無其他更好的辦法，但松墨天牛有優良的防護機制，外殼（幾丁質）即是其中之一。葡萄糖-6-磷酸異構酶（Glucose-6-phosphate isomerase， GPI）是參與糖代謝的糖酵解作用的一種酶，主要通過轉移碳位上的質子催化葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate， G-6-P）與果糖-6-磷酸（Fructose-6- phosphate， F-6-P）的相互轉換（Rose，1975）。GPI是一種非常保守的酶（Grauvogel et al.，2007），不僅參與糖代謝，還可在動物細胞中調節細胞分裂和生長因子活性（Funasaka and Raz，2007；Chiu et al.，2008），在昆蟲中參與幾丁質的合成（Candy and Kilby，1962）。因此，研究葡萄糖-6-磷酸異構酶可對松墨天牛的防治起到借鑒作用?！厩叭搜芯窟M展】自Noltmann（1964）首次從兔肌肉中分離GPI以來，關于GPI的研究報道逐漸增加，研究對象廣泛，主要有人類（鄭靜等，2012）、魚類（Cao et al.，2000）、植物及微生物等（Cui et al.，2010），較多涉及人類類風濕關節炎的研究；研究內容包括GPI的空間結構和生物活性等。但GPI在昆蟲領域的研究很少，僅見在桔小實蠅中有GPI基因克隆的報道，并通過饑餓飼喂和幾丁質含量測定等方法進行初步研究（陳力，2013）?！颈狙芯壳腥朦c】GPI在昆蟲幾丁質合成過程中起重要作用，但目前未見有關松墨天牛GPI的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】應用RACE技術克隆松墨天牛GPI基因cDNA全長，應用生物信息學技術分析其編碼蛋白理化性質；構建氨基酸序列比對圖譜及系統發育進化樹；模擬松墨天牛GPI三級結構，預測功能結構域，旨在為深入研究松墨天牛GPI的分子功能打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試松墨天牛成蟲采自廣州市從化區馬尾松次生林，將其置于液氮中冰凍，于-70 ℃保存備用。

主要試劑：E.Z.N.ATM Total RNA Kit II總RNA提取試劑盒購自OMEGA公司；3'-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase試劑盒、pMD20-T載體、大腸桿菌DH5α感受態細胞等試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；通用型DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 總RNA提取及cDNA第一鏈

參照總RNA提取試劑盒說明，取預先備好的松墨天牛成蟲20 mg，液氮研磨后提取松墨天?？俁NA，并用微量紫外分光光度儀（Nanodrop 2000）檢測其濃度和1.5%瓊脂糖電泳檢測其完整性。參照3'-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase試劑盒說明進行操作，反轉錄產物于-20 ℃保存備用。

1. 3 引物設計及3'RACE擴增

根據已克隆的含有5'端松墨天牛GPI基因cDNA片段序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物進行3'RACE擴增，上游引物（用于Outer PCR）：5'-

ACAAGCCCTTACTGTCGGTG-3'和下游引物（用于Inner PCR）： 5'-GTGGACCGTGTCTGCTTTC-3'。Outer PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行20個循環；72 ℃延伸10 min；-20 ℃保存。Inner PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環；72 ℃延伸10 min；-20 ℃保存。反應結束后，取5 μL PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。目的條帶純化回收后與pMD20-T載體重組過夜，再轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37 ℃培養過夜，經藍白斑篩選并進行菌落PCR鑒定后，挑選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 4 DNA序列及其編碼的氨基酸序列分析

使用DNASTAR軟件對松墨天牛GPI基因進行全長拼接；利用在線工具NCBI（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對拼接后的DNA序列進行BLAST比對；用DNAMAN軟件進行同源性分析；采用ClustalX和MEGA 5.0軟件進行系統發育進化樹構建（NJ法）；采用ProtPram軟件進行理化性質分析；采用ProtScale分析疏水性；采用SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）預測信號肽；采用SMART在線工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_ gor4.pl）預測二級結構；采用NCBI Conserved Domains在線網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi）分析氨基酸序列的結構功能域；采用3D-JIGSAW Protein Comparative Modelling Server在線工具（ttp：//bmm.crick.ac.uk/～3djigsaw/）對MaGPI進行三級結構模擬，再用Rasmol軟件對其進行視化處理。

2 結果與分析

2. 1 基因克隆

通過TA-克隆法測序得到目的片段3'端，與已克隆得到的含有5'端cDNA片段序列拼接后得到1038 bp的松墨天牛GPI基因全長序列，命名為MaGPI（GenBank登錄號：KU323592）。MaGPI包含840 bp開放閱讀框（ORF）和3'端非編碼區198 bp，編碼279個氨基酸。采用ProtPram軟件分析氨基酸序列的理化性質，結果顯示，該蛋白分子質量為31.75 kD，等電點為6.27，分子式為C1441H2215N375O415S10，為穩定蛋白。采用ProtScale在線工具分析MaGPI的疏水性，結果表明該蛋白為親水蛋白，最小值為-2.578，最大值為1.789。SignalP在線工具預測MaGPI沒有信號肽；NetPhos 2.0網站預測MaGPI有6個絲氨酸（Ser）磷酸化位點，4個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點，3個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點；DictyOGlyc在線工具預測表明該蛋白沒有糖基化位點。

2. 2 同源比對分析

通過MaGPI的840 bp完整開放閱讀框推導出由279個氨基酸殘基的多肽序列，在NCBI上進行BLASTP同源搜索，獲得約50個昆蟲的GPI的氨基酸序列。經同源性比對，MaGPI序列與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）的同源性最高，高達90%，與家蠶（Bombyx mori）的同源性最低，為76%，與其余物種的同源性在80%以上（圖1）。

2. 3 系統發育進化樹分析

基于MaGPI及8種昆蟲（鞘翅目、膜翅目、雙翅目、半翅目、鱗翅目）的GPI，采用NJ法構建系統發育進化樹。結果表明，松墨天牛與赤擬谷盜的同源性最高，在同一分支上；與家蠶的同源性最低（圖2）。

2. 4 蛋白結構分析

采用SMART軟件分析MaGPI的二級結構，結果顯示該蛋白序列41.94%為α螺旋，20.43%為β片層， 37.63%為隨機卷曲。采用COILS軟件分析卷曲螺旋結構發現，MaGPI在97～136位點處可形成螺旋卷曲。通過TMHMM軟件分析跨膜結構，結果顯示MaGPI整條肽鏈均在膜外，并不存在跨膜結構域，因此該卷曲螺旋可能為MaGPI的功能結構域。

通過3D-JIGSAW Protein Comparative Modelling Server軟件對MaGPI進行三級結構模擬，再經Rasmol軟件處理，發現該蛋白有8個明顯螺旋結構（圖3），在中間含有一個明顯的空位（如紅色箭頭處）。

2. 5 功能結構域分析

NCBI Conserved Domains軟件分析發現，MaGPI隸屬于糖磷酸異構酶家族，為葡萄糖-6-磷酸異構酶。該蛋白具有5個保守結構域（圖4）：（1）活性位點為41～208；（2）變構位點S151SLVSRTRVKT161；（3）活性部位蓋子A163QDTLEANARFFGNDISKVP182；（4）多肽結合位點為150～232；（5）多肽結合位點為168～247。

3 討論

本研究采用RACE技術克隆了松墨天牛GPI的cDNA全長，該基因序列全長1038 bp，包含840 bp的開放閱讀框和10個poly（A）尾巴結構，可編碼279個氨基酸，同源性比對和系統發育進化樹分析結果表明MaGPI與其他昆蟲同源性在76%以上，與赤擬谷盜的同源性最高，達90%。可見，MaGPI與其他昆蟲的GPI，特別是與鞘翅目昆蟲在序列結構上具有較高的保守性。

為研究MaGPI的結構與功能的關系，本研究采用3D-JIGSAW軟件對其進行結構模擬和NCBI Conserved Domains軟件分析其功能結構域，結果表明，MaGPI三級結構多為α螺旋，功能位點包括活性位點、變構位點、活性部位蓋子和兩個多肽結合位點。通過分析其他昆蟲序列，發現昆蟲在這些位點上也相當保守，這些信息為下一步研究其表達模式和功能打下了基礎。但是，這些功能位點的具體機制尚不明確，需要進一步探究。

GPI是一種二聚酶，能催化葡萄糖-6-磷酸與磷酸-

6-果糖間的轉換。該酶也能影響機體內細胞分裂和生長因子活性，近年來多作為一種自身免疫性抗原進行研究，尤其是與人類的類風濕關節炎疾病有關（Zhu and Feng，2013）。GPI是必需的看家酶，由單一的基因位點編碼，因此干擾該基因會導致有機體死亡。有研究表明，若老鼠缺失GPI基因將會導致胚胎死亡（Kugler and Lakomek，2000），但在昆蟲中未見有關GPI基因干擾的報道，僅明確GPI是昆蟲的幾丁質合成通路的八大酶之一（Candy and Kilby，1962），在幾丁質合成過程中不可或缺，而其合成機制有待深入探討。本研究結果豐富了松墨天牛幾丁質合成通路基因的遺傳信息，為深入探討幾丁質合成機制提供了分子依據。

幾丁質合成過程中除了不能缺少GPI外，還不能缺少其他7種酶，分別為：己糖激酶（Hexokinase）、海藻糖酶（Trehalase）、葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉移酶（Glucosamiine-6-phosphate-N-acetyltransferase）、谷氨酰胺：6-磷酸果糖轉移酶（Glucosamine-6-phosphate aminotransferase）、磷乙酰氨基葡萄糖變位酶（Phosphoacetylglucosamine mutase）、幾丁質合成酶（Chitin synthase）和UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶（UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase）（Kugler and Lakomek， 2000），若缺少其中的某種酶，將會導致幾丁質合成通路受阻，使昆蟲因缺少幾丁質而不能存活。近年來，通過干擾和破壞幾丁質的生物合成防治昆蟲的研究逐漸增多，主要集中在幾丁質合成抑制劑的使用方面，研究發現幾丁質合成抑制劑的防治效果明顯優于傳統的化學試劑（劉炳榮和鐘俊鴻，2006；趙忠偉等，2011）。通過研究MaGPI的結構信息，可為研究其在幾丁質合成通路中的具體機制，進而為研發優良的生物殺蟲劑打下了基礎。

4 結論

克隆獲得松墨天牛GPI基因cDNA全序列，包括840 bp開放閱讀框，共編碼279個氨基酸，采用信息學軟件分析，發現MaGPI為親水蛋白，與赤擬谷盜（T.castaneum）同源性達90%，含有5個功能位點：活性位點、變構位點、活性部位蓋子和兩個多肽結合位點。

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（責任編輯 溫國泉）