免疫膠體金技術在臨床檢測領域的應用進展

王 劭

（欽州市靈山縣人民醫院檢驗科，廣西 欽州 535400）

膠體金又被稱為金溶膠，是指在檸檬酸三鈉等還原劑的作用下，將金鹽還原成金后所形成的金顆粒懸液。膠體金具有大小均勻的特點，在靜電作用下會處于穩定狀態。免疫膠體金技術（immune colloidal gold technique）是以膠體金作為示蹤標記物，利用特異性抗原抗體反應，在光鏡、電鏡下對抗原或抗體進行定位、定性、定量檢測的一種新型檢測技術。近年來，免疫膠體金技術在臨床檢測領域得到了廣泛應用。本文就免疫膠體金技術在臨床檢測領域的應用進展進行綜述。

1 免疫膠體金技術的概述

1971 年Faulk 和Taytor 將膠體金引入到免疫化學領域。此后免疫膠體金技術作為一種新的免疫學檢測方法，在生物醫學領域得到了日益廣泛的應用。近年來隨著現代醫學技術的進步及多克隆抗體技術、單克隆抗體技術的逐漸成熟，免疫膠體金技術逐漸得到發展和完善。目前，免疫膠體金技術被臨床上廣泛應用于腫瘤檢測、心血管疾病的臨床診斷、免疫系統評估等領域，并發揮著重要作用。近年來隨著臨床檢測技術的不斷完善與發展，一些學者開始嘗試將免疫膠體金技術與免疫比濁法、斑點滲透法等相結合，應用于臨床檢測工作中。將上述幾種檢測技術有機結合后，能夠實現對血藥濃度、細胞因子、蛋白質等涉及復雜生物活性的半定量或定量檢測，且具有檢出率高、檢測的速度快等優勢。在采用免疫膠體金技術進行臨床檢測時，不需要使用昂貴的儀器和設備，且對檢測人員工作經驗的要求不高，這為該技術的推廣應用奠定了良好的基礎[1]。

2 免疫膠體金技術的應用現狀

2.1 電鏡標記技術

從免疫膠體金技術早期的應用情況來看，該技術最早被廣泛應用于掃描電子顯微鏡鏡檢中。膠體金顆粒具有高電子密度及球形外觀等特點，將其應用于掃描電子顯微鏡鏡檢中能夠精準地發現糞便幽門螺桿菌抗原等物質。在檢測期間，因為制備方法的不同，會導致膠體金顆粒的大小存在差異。通常情況下，膠體金顆粒的直徑為20 ～150 nm，但也有少數膠體金顆粒的直徑為3 ～19 nm。正是由于膠體金顆粒直徑的不同，在掃描電子顯微鏡鏡檢中應用免疫膠體金技術才能更好地實現單標記、雙標記及多標記等功能，并顯示出不同的抗原。有學者制備了血小板膜糖蛋白，在采用不同粒徑的膠體金對血小板膜糖蛋白進行標記后，經微波固定的方式有效地將膠體金探針定位到血小板表面及其內部的膜糖蛋白上，取得了令人滿意的效果。趙艷秀等[2]認為，采用免疫膠體金技術進行定性檢測、半定量檢測與定量檢測能顯著提高檢測的效率，具有先進性。

2.2 斑點免疫金滲濾技術

斑點免疫金滲濾技術最早出現于20 世紀80年代，是在固相免疫測定法的基礎上發展而來的一種新型檢測技術。作為一種初篩的檢測手段，斑點免疫金滲濾技術能滿足多種疾病的臨床檢測要求。有研究指出，采用斑點免疫金滲濾技術進行糞便隱血檢測能提高診斷的靈敏度，且該技術的抗干擾能力與傳統的鄰甲苯胺法相比更具有優勢[3]。有學者對斑點免疫金滲濾技術進行了橫向比較，分別采用流式微球載體技術（flow microbeads assay，FMA）、酶聯免疫吸附法和斑點免疫金滲濾技術檢測血清梅毒抗體，結果顯示，用這三種技術檢測血清梅毒抗體的特異性均為100%，用FMA、酶聯免疫吸附法、斑點免疫金滲濾技術檢測血清梅毒抗體的靈敏度分別為100%、96%、94%[4]。由此可見，斑點免疫金滲濾技術在血清梅毒抗體檢測中可發揮重要的作用。該技術將膠體金作為標記物，在不影響蛋白質活性的前提下能夠依托其穩定的性質來完成有效檢測，具有檢測的速度快、效率高等優點。

2.3 膠體金免疫層析技術

免疫層析技術是一種免疫檢測技術，其特點是應用抗原- 抗體免疫學反應和層析反應，可快速、準確地完成相應的檢測工作。早在20 世紀90 年代，有學者就在免疫膠體金技術的基礎上進行改進，找到了一種更加便捷、高效的檢測技術，即膠體金免疫層析技術。有學者以膠體金為標記物制備赤霉素單克隆抗體- 膠體金偶聯物，以競爭抑制模式制備赤霉素膠體金免疫層析試紙條，用該試紙條對豆芽中的赤霉素進行檢測，結果顯示，用該試紙條對豆芽中的赤霉素進行檢測的檢出限為100 μg/kg，靈敏度為98%，特異性為97%，假陰性率為2%，假陽性率為3%[5]。有學者對膠體金免疫層析法在臨床檢測領域的應用優勢進行了分析，總結其優勢為：1）可提高診斷的靈敏性。例如，在采用膠體金免疫層析法對蛋白A 抗體進行檢測時，樣品在經過狹窄的硝酸纖維素膜后能將被檢測物質濃縮，因此可顯著提高檢測效率和診斷的靈敏性。2）可提高診斷的特異性。在采用膠體金免疫層析技術進行臨床檢測時通常選擇純品為抗原，可提高診斷的特異性。另外，檢測時所用膠體金顆粒的直徑越小，檢測的效果越好[6]。3）具有很好的穩定性與可重復性。4）被膠體金標記的樣品在4℃的環境中可儲存2 年以上，且無信號衰減的現象。在采用膠體金免疫層析技術進行臨床檢測時，膠體金的穩定性是影響最終檢測結果的關鍵。近年來隨著膠體金制備工藝的逐漸成熟（例如優化了膠體金標記的最佳條件和膠體金顆粒懸浮的最佳配方等），膠體金的穩定性得到了顯著提升。此外，隨著膠體金免疫層析技術的不斷完善，一些學者開始將該技術應用于疫情檢測工作中。梁秋光等[7]利用膠體金免疫層析技術對含鼠疫的45 份陽性血清進行檢測，最終的檢測結果顯示，這45 份樣品的檢測結果均呈陽性。

3 免疫膠體金技術在半定量與定量檢測中的應用

膠體金本身的顏色以粉紅色、紅色為主。通常情況下，采用光學傳感器或在肉眼下可直接觀察到膠體金顏色的變化，故通過免疫膠體金技術可實現半定量及定量檢測。

3.1 免疫膠體金技術在半定量檢測中的應用

在免疫膠體金技術出現后不久，就有學者嘗試采用該技術進行半定量檢測。采用免疫膠體金技術進行半定量檢測的依據是：硝酸纖維素膜的顯色面積與抗體濃度呈正相關。有學者建立了一種伴有質控點的免疫金滲濾技術，用于半定量檢測人尿中的微量白蛋白，結果證實，用該技術半定量檢測人尿中微量白蛋白的結果可靠，且方便快捷，特別適合中、小醫院和門診使用[8]。

3.2 免疫膠體金技術在定量檢測中的應用

現代醫學技術的發展帶動了免疫膠體金技術的變革。當前，不少醫院在臨床檢測工作中開始大面積推廣使用膠體金免疫定量檢測儀。該儀器的出現進一步提高了免疫膠體金技術的檢出效率，并推動了定量檢測技術的完善與發展。采用免疫膠體金技術進行定量檢測的原理是：將硝酸纖維素膜上檢測線的顏色變化及待測物質濃度的線性比例與標準曲線進行對比，可獲得最終的定量分析結果[9]。膠體金試劑條對于不同物質的顯色過程是動態變化的，且試劑條的生產工藝、質量標準等都會導致檢測結果出現變化。近年來臨床上在采用免疫膠體金技術進行定量檢測時，為了能夠進一步提升檢測結果的精準度，開始嘗試使用一種新的定量檢測方法，即T/C（檢測線/ 質控線）法。與采用傳統的免疫膠體金技術進行定量檢測相比，采用T/C 法進行定量檢測有助于降低溫度、時間等外部因素對最終檢測結果的影響[10]。

4 免疫膠體金技術與新技術的結合

4.1 免疫膠體金技術與魯米諾檢測技術的結合

魯米諾又叫發光氨，是一種化學熒光分子，其被單氧氧化后可發出藍光并被肉眼所察覺。魯米諾試劑可以顯現出極微量的血跡形態（潛血反應），故魯米諾檢測技術被廣泛應用于刑事偵查、生物工程、化學示蹤等領域。有學者在魯米諾探針的基礎上開發出了具有良好響應特性的單探針，經魯米諾的還原作用成功制備了雙響應魯米諾還原膠體金，最終的試驗結果證實，雙響應魯米諾還原膠體金可在靜電相互作用下標記抗體[11]。有學者建立了小鼠實驗模型，對魯米諾還原膠體金的檢測價值進行研究，結果證實，使用魯米諾還原膠體金能夠更快速地完成對蛋白質的檢測，且膠體金中的發光體所產生的化學發光信號能夠達到定量檢測的要求；化學發光信號的線性范圍為0.1 ～100 ng/mL，檢出限為0.033 ng/mL，與傳統檢測技術相比檢出限更低；從成本方面來看，應用魯米諾還原膠體金時由于不需要使用復雜的光學儀器，故其在價格上也具有優勢[12-13]。

4.2 免疫膠體金技術與表面增強拉曼光譜技術的結合

表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman spectra，SERS）與紅外光譜同屬于分子振動光譜，可反映分子的特征結構。SERS 技術具有超敏感性和非破壞性的特點，是一種新型的生物檢測技術。與傳統的生物檢測技術相比，SERS 技術可為生物檢測提供全面的“分子指紋”，能夠用于檢測樣品中的固有信號。SERS 技術的檢測原理是：在應用該技術時，可將待測分子吸附在粗糙的納米金屬材料表面，使待測物的拉曼信號增強多達14 個數量級，這不僅能完成特定范圍內的分子檢測，還能用于單個根元素的檢測[14]。針對該技術的優勢，目前醫學界開發出了一種新型的免疫探針，由拉曼探針分子、新霉素單克隆抗體和雙標記膠體金組成。該免疫探針可獲得更強的拉曼信號，能在短時間內完成臨床檢測，且檢出限低至0.285 pg/mL，明顯低于常規免疫膠體金技術2.73 ng/mL 的檢出限[15]。

5 小結

在臨床檢測領域，免疫膠體金技術具有廣闊的應用前景。免疫膠體金技術通過與諸多先進的臨床檢測技術相結合，能夠充分滿足復雜條件下臨床檢測的需求，這也是未來臨床檢測領域發展的新方向。