天津地區辣椒病毒病調查及毒源種類初步鑒定

高葦　王勇　張春祥　張安盛　竺曉平

摘要：本研究對天津5個區縣辣椒病毒病的發生情況進行初步調查，并利用6種常見蔬菜病毒的抗體采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（DAs-ELISA）鑒定采集到的228份病毒樣品。結果表明，有186份樣品呈陽性，黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）檢出率最高，達42.25%，為天津地區辣椒的優勢毒源種類；煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、蠶豆萎蔫病毒（Broadbean wilt virus，BBWV）、番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）檢出率分別為37.43%、28.34%、17.65%和20.86%；并首次在天津武清地區檢出番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilf virus，TSWV）侵染辣椒。調查還發現天津地區辣椒存在2種及2種以上病毒復合侵染。

關鍵詞：辣椒；辣椒病毒病；ELISA檢測；病原鑒定；天津

中圖分類號：S436.418.1⁺2 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942（2016）03—0091—04

辣椒（Capsicum annuum L.）作為全世界重要的蔬菜作物，是人們生活中必備的蔬菜和調味品，目前我國辣椒栽培面積和總產量位居世界第一位。近年來，隨著設施栽培技術的發展、田間濕度的增加，辣椒病害發生的種類增多，發生程度加重，其中辣椒病毒病的發生更為嚴重。1923年，Doolittle首次報道了黃瓜花葉病毒（CMV）侵染辣椒，到目前為止已報道的侵染辣椒的病毒種類至少有45種。近年來，隨著栽培環境和氣候條件的變化，辣椒病毒病在天津地區有日益加重的趨勢，一般年發病率在30%～50%，導致減產10%～30%左右，發病嚴重的地區甚至絕收，對辣椒生產造成了巨大的經濟損失。

不同毒源引起的辣椒病毒病在癥狀上具有相似性，主要表現為黃化、蕨葉、植株矮小等，難以從癥狀上確定毒源的種類。目前，還沒有系統地鑒定過危害天津地區辣椒的主要毒源種類，因此生產上對辣椒病毒病的防治存在較大的盲目性。2013年，筆者在天津市5個農業生產區縣進行了大量病害調查及病毒樣本采集，并利用DAS-ELISA檢測方法對病毒樣本進行鑒定，以明確天津地區辣椒病毒病的發生情況和主要毒源種類，為天津地區辣椒病毒病的防治及抗病育種工作的開展提供參考和依據。

1材料與方法

1.1發病情況調查與樣品采集

2013年，在天津市周邊5個區縣（武清區、西青區、北辰區、寧河縣和靜海縣）辣椒種植基地25塊生產田開展辣椒病毒病調查，并隨機采集葉片黃化、畸形、皺縮，植株矮小等疑似感染病毒病的樣本。將樣本統一編號、照相和癥狀記載，并分別裝入標記的自封袋中，于-80℃冰箱中保存備用。

1.2樣本處理

取樣本在預冷的研缽中研磨均勻，將獲得汁液與樣品提取緩沖液按1：10的比例稀釋，4000r/min、4℃下離心5 min，取上清液進行DAS-ELISA檢測。

1.3 ELISA檢測

將CMV、TMV、ToMV、TSWV、BBWV、TYLCV六種包被抗體（AC Diagnostics公司提供）分別加入到酶標板孔中，置于4℃條件下包被過夜。棄去包被液，充分洗滌3次，吸去孔內殘液。將100μ1.2中獲得的樣本液作為待測抗原加入到酶標板中并做好標記（陽性對照加入100 μL相應病毒陽性樣品，陰性對照加入100μL樣品稀釋緩沖液），26℃下孵育2 h，倒掉液體，洗滌3次，吸水紙吸干孔內殘液。加入現配的堿性磷酸酶（AP）標記的二抗，37℃溫育2 h。洗滌后，采用新鮮配制的PNP底物溶液進行顯色。用ELX800酶標儀在405 nm處測定各反應OD值，通過檢測樣本OD值（P）和陰性樣本OD值（N）的比值，判斷抗血清的效價。P/N>2.0時為陽性反應，P/N<1.5為陰性反應。

2結果與分析

2.1天津地區辣椒病毒病的發生情況

于天津5個區縣共采集到疑似辣椒病毒病樣本228份，發現天津地區辣椒病毒病發生較為嚴重，其癥狀主要表現為蕨葉型（圖1a）、花葉型（圖1b）和黃綠相間斑駁型（圖1c），花期表現為開花率較低，發病后期整株矮小。調查還發現，露地栽培辣椒病毒病的發病率顯著高于溫室栽培辣椒；武清地區蕨葉型辣椒病毒病的發生較為普遍，發病率最高田塊可達70%左右；靜海縣辣椒病毒病的主要癥狀以花葉型為主，發病率最高田塊可達80%；而西青區、北辰區和寧河縣辣椒病毒病發生率較低，少于20%，大多是花葉和蕨葉型混發（表1）。

2.2辣椒病毒樣本DAS-ELISA檢測

對228份疑似辣椒病毒病樣品進行DAS-ELISA檢測進而判斷其致病毒源種類，結果表明，有186份樣本呈陽性反應，受到CMV、TMV、ToMV、TSWV、BBWV和TYLCV六種病毒中的1種或1種以上侵染。其中，CMV病毒檢出率最高，為42.25%，TMV、ToMV、BBWV和TYLCV病毒的檢出率分別為37.43%、28.34%、17.65%和20.86%，同時在武清區檢出1份TSWV病毒侵染樣本，為天津地區首次檢出報道。天津5個區縣辣椒病毒病的毒源種類具有明顯差異（圖2），CMV和TMV為兩種主要毒源種類。武清區和西青區毒源以CMV為主；北辰區和靜海縣主要毒源為TMV；寧河縣毒源種類較為豐富，CMV、ToMV、TYLCV和BBWV 4種病毒的檢出率相似，均在30%左右。

2.3病毒復合侵染

DAS-ELISA檢測顯示，186份陽性樣品中，單一病毒侵染率為44.09%，有104份樣品（55.91%）檢測到2種或2種以上病毒侵染，說明天津地區辣椒病毒病毒源種類豐富，復合侵染率較高（表2）。在辣椒病毒病復合侵染中以2種病毒復合侵染為主，共有85份。其中，CMV和TMV病毒混發的檢出率最高，為13.60%，主要在武清和西青地區樣本中檢出。另外，CMV與ToMV混發樣本檢出率為8.33%，這與田間癥狀多以花葉和蕨葉混發為主的特征一致。2種病毒復合侵染以CMV、TYLCV、BBWV與其它病毒混合侵染為主。其中，BBWV復合侵染的病毒檢出樣本均采自寧河縣造甲城鎮造甲村露地栽培的辣椒上，可能與當地露地栽培品種復雜、不同蔬菜品種上的病毒復合侵染有關。ToMV與其它病毒混發樣本主要集中在靜海和寧河縣。3種病毒復合侵染的檢出率顯著低于2種病毒復合侵染，CMV+TYLCV+ToMV檢出率為2.63%，ToMV+TYLCV+BBWV檢出率為3.51%，TMV+BBWV+ToMV檢出率1.75%。另外，在天津地區僅檢出1份樣本受到4種病毒復合侵染，復合侵染病毒種類為CMV+TMV+TYLCV+BBWV，該樣本采自寧河縣露地栽培辣椒。

3結論與討論

近年來，辣椒病毒病的發生尤為嚴重，由原來的次要病害逐漸上升為主要病害，嚴重影響辣椒的產量和品質。本研究對天津地區辣椒病毒病的發生情況進行調查，發現該地區辣椒病毒病的發生率平均在20%～30%，露地辣椒的發生率顯著高于設施栽培辣椒，這與病毒病的傳播媒介主要為蚜蟲、薊馬、粉虱等具有顯著相關性。天津地區辣椒病毒病的癥狀以黃化、蕨葉、花葉、皺縮、植株矮小為主，難以從癥狀上判斷病原種類，一旦發生難以控制，顯著降低辣椒產量和農民收入。本研究利用DAS-ELISA方法對天津地區采集的辣椒病毒病樣品進行毒源鑒定，結果CMV、TMV、ToMV、TSWV、BBWV和TYLCV六種常見病毒均有檢出，其中TSWV病毒為天津地區的首次檢出報道。目前，我國北京、遼寧、江蘇、吉林、四川、陜西、重慶等地區均廣泛開展了辣椒病毒病毒源種類調查，先后報道了CMV、TMV、PVX、PVY、TEV、PMMoV、AMV、BBWV、TSWV、TYLCV、GYSV、CaCV、TMGMV等16種病毒侵染辣椒。調查顯示辣椒病毒病的主要毒源以CMV和TMV為主，而且常常是2種或2種以上病毒復合侵染，這與天津地區辣椒病毒病的發生及種類具有相似性。天津地區不同區縣優勢毒源種類具有明顯差異，武清區和西青區毒源以CMV為主；北辰區和靜海縣主要毒源為TMV；寧河縣毒源種類較為豐富，CMV、ToMV、TYLCV和BBWV 4種病毒的檢出率相似，均在30%左右，這很可能與當地的栽培環境及栽培品種有關。此外，病毒CMV極易與其它毒源復合侵染，常表現為2種病毒復合侵染，占總陽性樣本檢出率的31.18%。另外，露地栽培辣椒病毒復合侵染的發生率顯著高于設施栽培辣椒，這與露地混合栽培品種多樣、易發生交叉侵染相關。結合檢測結果及病毒病發生特點分析，筆者認為辣椒病毒病防治應主要采取預防措施，通過有效應用防蟲網、黃板等手段避免傳播媒介滋生、擴散。

本研究僅采用6種常見蔬菜病毒抗體對采集到的228份疑似樣本進行檢測，無法涵蓋天津地區辣椒病毒病的所有毒源種類，該地區是否有其它毒源種類仍需進一步鑒定。另外，由于病毒病癥狀復雜，無法將毒源種類和癥狀進行顯著關聯，對于辣椒病毒病癥狀診斷的實現有待進一步研究。