金線蓮組織培養快繁技術試驗

汪佳秀 武艷艷 鐘田坤

摘 要 目的：建立金線蓮無菌繁殖體系。方法：以金線蓮植株莖段為外植體，分析莖段不同位置、培養基、生長調節劑和添加物對不定芽增殖和幼苗生長的影響。結果：外植體以中間段莖節（不含頂芽和長根）為宜，一步成苗最佳培養基配方為MS培養基+IBA（吲哚乙酸），用量為10 mL/L，香蕉100 g/L，活性炭2 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值5.8；不定芽增殖最佳培養基為MS培養基+TDE，用量為0.1 mL/L，土豆汁100 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8；壯苗生根最佳培養基為1/2MS，生長調節劑添加適宜量為6-BA（0～0.5 mg/L）+NAA（3.0～4.0 mg/L），香蕉（20.0%）對促進幼苗生長有利，活性炭（0.3%）具有一定的促進作用；試管苗移載適宜基質為丹麥泥炭土，成活率可達到96%。結論：合理利用金線蓮組培快繁技術，建立無菌繁殖體系，能夠實現金線蓮幼苗的快速繁殖。

關鍵詞 金線蓮；不定芽誘導；壯苗培養

中圖分類號：Q944.6 文獻標志碼：B 文章編號：1673-890X（2016）06-0-03

金線蓮中富含氨基酸、抗衰老活性微量元素，藥效價值較高，被視為珍惜名貴藥材，備受青睞。但受自身生長特點等因素影響，金線蓮在自然條件下萌發率和繁殖率較低，在藥品市場一直供不應求[1]。基于這一現狀，利用植物培養技術來提高金線蓮繁殖速度，加大人工培養規模，對保護金線蓮和穩定市場供應，均具有重要的現實意義。現將有關實驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

無菌繁殖體系建立為江西金線蓮野生種源，采集植株莖段，外植體以含頂芽莖段為主。

1.2 方法

1.2.1 一步成苗

1.2.1.1 無菌繁殖

取植株，去葉，先放入水中漂洗，再用流水沖洗，時間分別為5、30 min；以75%酒精浸濕，放入0.1%氯化汞溶液中，12 min后取出，用蒸餾水沖洗，取莖上段（即具莖尖）、中段和下段（即匍匐莖段），各1.5 cm，均帶有節間，并分別接種于備好的培養基上。

1.2.1.2 最佳培養基配方

MS培養基+IBA（吲哚乙酸），用量為10 mL/L，香蕉100 g/L，活性炭2 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值5.8；培養條件為：溫度（25±2）℃，光照時間和強度分別為12 h/d、1 800 lx左右[2]。

1.2.2 分步出瓶

1.2.2.1 不定芽誘導

通過單因素實驗考察基本培養基對不定芽誘導的影響，大量元素減半（1/2MS），其他成分不變，各加入6-BA和NAA，用量分別為4.0 mg/L、1.0 mg/L；選取無菌健壯植株，做前期處理，接10個莖節，均重復3次，以MS為培養基，梯級加入細胞分裂素和生長素，培養期間定時觀察不定芽生長情況，統計不定芽數，分析生長調節劑對不定芽誘導的影響；繁殖最適培養基為：MS培養基+TDE，用量為0.1 mL/L，土豆汁100 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8。

1.2.2.2 壯苗培養

以1/2MS為基本培養基，6-BA和NAA分別進行梯級處理，前者設1～5 mg/L，后者設0.5～1.5 mg/L，共計15個處理，分析生長調節劑對幼苗生長和發根的影響；另加6-BA（0.5 mg/L）和NAA（2.0 mg/L），考察天然有機物與活性炭對幼苗生長的影響；生根最適合培養基為：MS培養基+6-BA，用量為0.1 mL/L，IBA（吲哚乙酸）5 mL/L，香蕉提取液50 g/L，活性炭2 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值5.8；接入將增殖培養無根幼苗，高為3 cm左右，具在3～4節間，有1～2片，接種無根幼苗10株，重復3次，定期觀察生長情況。

1.2.2.3 移栽

選苗，高為7 cm左右，莖基直徑2 mm左右，叢生根2～3條，煉苗后洗凈培養基，移入裝有不同基質土盆中；移栽前，基質均用45%多菌靈可濕性粉劑，均以800倍溶液澆透消毒，具體條件為：陰棚遮陰度為80%，空氣相對濕度為85%左右；移栽3個月后，記錄成活株數[3]。

2 結果與分析

2.1 無菌繁殖體系建立和不定芽誘導影響分析

外植體莖段分化程度會影響到誘導結果，金線蓮莖段外植體不定芽誘導顯示，外植體上段的接種數共75段，萌動率為100.0%，不定芽數為47個，平均芽增值率為0.60倍，芽體生長勢旺且芽數少；外植體中段的接種數共166段，萌動率為100.0%，不定芽數為680個，平均芽增值率為4.03倍，芽體芽數較多且發育良好；外植體下段的接種數共94段，萌動率為85.2%，不定芽數為138個，平均芽增值率為1.71倍，芽體芽數較少且生長緩慢。基本培養基能夠萌發出不定芽體，但對誘導產生的影響較大，結果顯示，MS培養基芽體生長狀況最佳，其次1/2MS，與1/3MS比較差異較為明顯，表明MS和1/2MS培養基適合作為金線蓮經段不定芽誘導的基本培養基，詳見表1。

本次實驗所用生長調節劑為6-BA、KT和NAA，處理結果顯示：6-BA用量為1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L和6.0 mg/L，平均芽增長率分別為2.72倍、3.28倍、4.02倍、3.22倍；芽體生長變化趨勢為色嫩綠且芽較弱轉為色較率且芽較壯；KT用量為2.0 mg/L和4.0 mg/L，平均芽增長率分別為2.25倍、2.58倍，芽體生長狀況為色黃白且芽較弱；以6-BA 4.0 mg/L為準，加NAA，用量為0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L，平均芽增長率分別為5.36倍、4.58倍、4.16倍，芽體生長狀況為色濃綠且芽粗壯。從中能夠得出，生長調節劑添加量對金線蓮不定芽增殖的影響較大，且不同生長調節劑所產生的影響存在差異，在相同添加量下，6-BA的增值率明顯高于KT，表明6-BA更適合金線蓮莖節不定芽的誘導，添加適宜量為4.0 mg/L；NAA對金線蓮不定芽的誘導具有一定的促進作用，6-BA（4.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L），芽體生長狀況即能夠達到改善。

2.2 壯苗生根培養和移載成活影響分析

在金線壯苗生根培養中，6-BA和NAA添加量不同，壯苗凈增葉、發根數和鮮質量凈增量也存在一定差異。多次處理結果顯示，6-BA（0.5 mg/L）+NAA（1.0 mg/L），平均凈增葉為1.8片，發根數為2.2條，鮮質量凈增量為539.5 mg；6-BA（1.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L），平均凈增葉為1.3片，發根數為2.2條，鮮質量凈增量為525.8 mg；6-BA（1.5 mg/L）+NAA（1.0 mg/L），平均凈增葉為1.1片，發根數為1.4條，鮮質量凈增量為450.2 mg；6-BA（0.5 mg/L）+NAA（2.0 mg/L），平均凈增葉為3.2片，發根數為2.6條，鮮質量凈增量為588.2 mg；6-BA（1.0 mg/L）+NAA（2.0 mg/L），平均凈增葉為2.1片，發根數為2.8條，鮮質量凈增量為583.4 mg；6-BA（1.5 mg/L）+NAA（2.0 mg/L），平均凈增葉為1.6片，發根數為1.7條，鮮質量凈增量為466.2 mg；6-BA（0.5 mg/L）+NAA（3.0 mg/L），平均凈增葉為4.3片，發根數為3.7條，鮮質量凈增量為700.6 mg；6-BA（1.0 mg/L）+NAA（3.0mg/L），平均凈增葉為3.3片，發根數為3.0條，鮮質量凈增量為622.8 mg；6-BA（3.0 mg/L）+NAA（1.5 mg/L），平均凈增葉為3.0片，發根數為2.2條，鮮質量凈增量為524.6 mg；6-BA（0.5 mg/L）+NAA（4.0 mg/L），平均凈增葉為3.7片，發根數為3.3條，鮮質量凈增量為662.8 mg；6-BA（1.0 mg/L）+NAA（4.0 mg/L），平均凈增葉為2.6片，發根數為2.6條，鮮質量凈增量為584.8 mg；6-BA（1.5 mg/L）+NAA（4.0 mg/L），平均凈增葉為2.3片，發根數為2.4條，鮮質量凈增量為535.8 mg。綜合比較來看，在金線壯苗培養中，6-BA適宜添加量為0～0.5 mg/L，NAA適宜添加量為3.0～4.0 mg/L。

不同添加物你對金線蓮幼苗生長的影響存在一定的差異，結果顯示，香蕉對促進幼苗生長有利，土豆汁對促進幼苗生長不利，活性炭具有一定的促進作用，詳見表2。本次實驗種植基質以丹麥泥炭土為基質，試管苗移載成活率達到96%。

3 討論

金線蓮莖段不同部位、培養基、生長調節劑和添加物對不定芽增殖、幼苗生長均會產生一定的影響，有必要建立無菌繁殖體系，確定金線蓮幼苗快速繁殖的條件[4]。本次實驗結果顯示，外植體以中間段莖節（不含頂芽和長根）為宜，一步成苗最佳培養基配方為MS培養基+IBA（吲哚乙酸），用量為10 mL/L，香蕉100g/L，活性炭2 g/L，白砂糖30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值5.8；不定芽增殖最佳培養基為MS，生長調節劑添加適宜量為6-BA（4.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L）；壯苗生根最佳培養基為1/2MS，生長調節劑添加適宜量為6-BA（0～0.5 mg/L）+NAA（3.0～4.0 mg/L），香蕉（20.0%）對促進幼苗生長有利，活性炭（0.3%）具有一定的促進作用；試管苗移載適宜基質為丹麥泥炭土，成活率可達到96%。組織培養所獲得的金線蓮植株與野生金線蓮生長環境不同，在藥用成分和藥理活性方面可能存在一定的差異，這一問題還有待進一步研究。

參考文獻

[1]周銳，孔瓊，薛春麗，等.屏邊野生金線蓮組培快繁技術研究[J].云南農業科技，2014，10（4）：7-10.

[2]周錦業，丁國昌，何荊洲，等.不同光質對金線蓮組培苗葉綠素含量及葉綠素熒光參數的影響[J].農學學報，2015，11（5）：67-72.

[3]袁小鈴，王建棟，王思雨，等.金線蓮組培快繁體系優化及多糖含量測定[J].浙江農業科學，2015，12（7）：983-985.

[4]魏翠華，秦建彬，謝宇，等.應用正交設計法優選臺灣金線蓮快繁培養基[J].中國農學通報，2013，10（4）：114-117.

（責任編輯：劉昀）