液相色譜—串聯質譜測定水產品中硝基呋喃類藥物殘留

蔣翠紅

摘 要 目的：使用液相色譜-串聯質譜分析水產品中的硝基呋喃類藥物的殘留情況。方法：使用乙酸乙酯液相色譜分離技術提取殘留在水產品中的藥物含量，并進行電噴霧串聯質譜方法的檢測活動。結果：硝基呋喃類藥物在水產品中的含量保持在1～50 ng/ mL范圍之內，比標準的范圍值低10.4%。結論：這種方法具有準確性、靈敏性、專屬性，對分析水產品中含硝基呋喃類藥物含量非常的有效。

關鍵詞 液相色譜-串聯質譜；硝基呋喃類藥物；水產品

中圖分類號：TS254.7；O657.63 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2016）06--02

硝基呋喃類藥物是一種綜合型的光譜抗生素，具有預防畜禽胃腸道疾病的發生作用，經常用作飼料添加劑。這種藥物帶有慢性毒性，長期使用對動物產生一定的毒素，引起癌變、畸形等。這種藥物在動物體內半衰期短，代謝速度快，可以長時間的殘留與代謝，并伴有毒性，因此，對其進行檢測，是為了更好地監控其在水產品中的殘留情況。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯質譜，震蕩器、離心機、氮吹儀。乙腈，甲醇，乙酸乙酯，正己烷均為色譜純；50 mmol/L 2-硝基苯甲醛；0.125 mol/L鹽酸溶液；1 mol/L氫氧化鉀溶液；1 mol/L磷酸氫二鉀溶液。硝基呋喃及同位素內標標準溶液：分別準確稱取10 mg的AOZ、SEM、AHD、AMOZ、AMOZ-D5、AOZ-D4、AHD-D3、SEM-13C15標準品（純度>98.0%），用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，各組分濃度均為100 ?g/mL。

1.2 樣品前處理

提取粉碎魚肉2.00 g放在50 mL的離心管里，并加入150 ?g的內標混合工作液，加入適量的鹽酸溶液均勻的搖晃30 s，再使用5 mL的0.125 mol/L鹽酸溶液進行洗滌勻漿刀，與鹽酸溶液一起放入離心管里。再加入2-肖基苯甲醛，搖晃半分鐘后放于搖床中進行反應。將離心管中的上清液倒入另一個離心管中進入調試環節，保持pH數值在7～7.5。加入7 mL的乙酸乙酯進行分離，并要重復上述步驟，最后使用氮吹儀進行吹干處理，使用乙腈和乙酸水溶液對殘渣進行溶解，并加入正己烷進行脫脂，將得到的下層溶液在12 000 r/min下進行離心10 min后，經過0.2 ?m濾膜的過濾，最后使用液相色譜-串聯質譜進行測定[1]。

1.3 液相色譜一串聯質譜測定

首先是液相色譜的條件：色譜柱100 mm×2.0 mm，粒度5 ?m，流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 ?L。流動相梯度洗脫見表1所示。其次是質譜條件：使用ESI的接口方式，霧化器6 mL/min，氣簾氣8 mL/min，加熱溫度450 ℃，碰撞氣5 mL/min，使用5 000 V的電離電壓，采用多反應選擇離子的監測方法作為掃描方式。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理

硝基呋喃類藥物的特點是代謝速度很快，與蛋白質結合在一起，呈現出結合狀態的模式依附于動物的體中，當遇到適合的酸度條件時，會產生釋放作用，代謝物的特點是小的分子化合物，分子的數值要保持在75～201，很難在質譜儀中產生特性的離子碎片，定性定量也非常的困難。本次試驗使用的是衍生化試劑的柱前衍生方法，同時進行酸水解與衍生化。當衍生環節完成以后，會加大了代謝物的分子的質量，一般在208～335范圍內，在合理的電壓作用下，可以產生2個以上的特征性離子碎片峰。

2.2 質譜條件優化

開啟ESI模式進行電離子活動，使用Q1開始掃描來確定每一組分母離子與子離子，將自動與手動結合在一起對代謝物進行離子化合物的分離與優化，并要對各種成分進行嚴格的檢測活動，包括靈敏度，如果靈敏度不相同，那么得到的離子源條件會出現嚴重的偏重問題。

2.3 pH值對硝基呋喃代謝物提取效率的影響

如表2所示，是樣品提取液pH數值對檢測結果的影響表。通過這些數據可以分析出，4種代謝物的提取效率都受到pH數值的影響，直接決定了試驗結果的準確性，并且嚴重的影響了每一組的保留時間，因此，采用這種方法進行試驗，對pH數值有非常高的要求，在進行提取液pH數值的調試過程中，要在間隔半分鐘以后重新測定，保證pH數值在7～7.5的范圍中。

2.4 標準工作曲線及檢出限

參照樣品前處理條件，按照色譜與質譜的測度條件對AOZ、SEM、AHD、AMOZ的標準混合工作液進行測定，如圖1所示，是對硝基呋喃代謝物的快速檢測圖樣。表4表示的是回歸方程、相關系數。依據儀器信噪比提供的數據，并參考了有關硝基呋喃代謝物檢測的數據資料，得出這種方法的檢出限是0.5 ?g/kg。

圖1 硝基呋喃代謝物的快速檢測

2.5 加標回收和精密度試驗

在不含有硝基呋喃類代謝物殘留物質的烤鰻身上進行添加抗生素藥物的回收與精密度的試驗，按照使用的方法分別加入了0.5、0.75、1.0 ?g/kg的抗生素溶液，根據實驗提供的數據可以有效的分析出4種代謝物質回收率的平均數值在88.8%～111.0%，小于或等于標準偏差的15%。

2.6 試驗中應注意問題

在進行硝基呋喃類代謝物在水產品中殘留的試驗時，要注意，硝基呋喃類代謝物在光合作用下，會進行分解反應，因此，在進行試驗的過程中，要注意避光。此外，試驗使用的樣品不同，得到的試驗結果也不相同，例如：使用面包蝦與蝦仁進行檢測的時候，得到的SEM結果是不同的。試驗使用的儀器設備、環境都會對試驗的結果帶來一定的影響，干擾檢測的結果。

3 結語

本文使用柱前衍生的方法，檢測出4種硝基呋喃類代謝物都是具有非常好的質譜特征的化合物，增加了檢測物質的定性與定量。使用同位素內標檢測、定量、測試的方法，是為了更好地提升試驗使用方法的回收率與精密度，根據三離子確證的原則，增強了使用方法的可靠性，保障了試驗樣品技術的正確性。

參考文獻

[1]王璟，楊楠，趙晶，等.液相色譜-串聯質譜法檢測水產品中硝基呋喃類代謝物[J].中國衛生檢驗雜志，2008（6）：978-980.

（責任編輯：劉昀）