Toll受體4的表達與胎膜早破患者絨毛膜羊膜炎的關系探討

李凱霞，劉福民

1.徐州醫學院研究生院，江蘇徐州 221004；2.淮安市婦幼保健院，江蘇淮安 223300

Toll受體4的表達與胎膜早破患者絨毛膜羊膜炎的關系探討

李凱霞1，劉福民2

1.徐州醫學院研究生院，江蘇徐州 221004；2.淮安市婦幼保健院，江蘇淮安 223300

目的探討分析Toll受體4（TLR4）的表達與胎膜早破患者絨毛膜羊膜炎的關系。方法隨機選取2013年1月—2015年4月胎膜早破病例30例（研究組）與正常晚期妊娠女性30例（對照組），分別測定胎盤組織TLR4定位、表達特點以及白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）水平，予以產后胎膜病理檢查。結果2組TLR4胎盤表達情況以及胎盤TLR4mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）；研究組血清IL-8水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。最終檢查發現組織絨毛膜羊膜炎23例，TLR4表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），TLR4mRNA水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者，組織絨毛膜羊膜炎者IL-6、IL-8水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者，差異有統計學意義（P＜0.05）。該組胎膜組織病理檢查確認為亞臨床型絨毛膜羊膜炎，三期急性炎性改變，Ⅰ期、Ⅱ、Ⅲ期改變逐漸明顯。結論TLR4上升以及IL-8上升均與絨毛膜羊膜炎有關聯，IL-8變化關系到胎膜完整性，對TLR4的監測是防控胎膜早破、絨毛膜羊膜炎的關鍵。

Toll受體4；表達；胎膜早破；絨毛膜羊膜炎

胎膜早破主要因感染所致，Toll樣受體與固有免疫左右有直接關聯，而TLRs作用于細胞信號轉導等環節，TLR4關系到內毒素信號傳導過程，且可能與胎膜早破絨毛膜羊膜炎的發生有關[1]，該研究隨機選取2013年1月—2015年4月胎膜早破病例30例為研究對象，探討分析了TLR4與胎膜早破絨毛膜羊膜炎之間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2013年1月—2015年4月胎膜早破病例30例（研究組）與正常晚期妊娠女性 30例（對照組），研究組年齡22～34歲，平均年齡（26.8±2.4）歲；對照組年齡23～33歲，平均年齡（26.3±2.8）歲，其中15例孕周在28～37周之間（對照1組），另15例孕周≥37周（對照2組）。2組基礎資料對比差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

2組均在剖宮產之時剪取臍帶附著處胎盤垂直斷面中央標本2塊，使用0.9%氯化鈉溶液將標本漂洗干凈，其中1塊以液氮冷凍處理，置于-70℃環境中備用，另1塊用來提取RNA。

2組孕婦分娩前均常規抽取肘靜脈血標本各5mL，高敏放射免疫測定標本中IL-6、IL-8水平，產后均在破口部分剪取胎膜組織標本，以10%甲醛固定送檢。

免疫組化。冰凍切片取出，厚度維持在10μm，并以冷丙酮固定處理、將內源性過氧化物酶去除。山羊血清與0.1%Triton X-100溶液通透細胞封閉處理。將兔抗人TLR2 IgG抗體滴到切片之上，置于4℃濕盒內一夜。取出后清洗，將生物素化山羊抗兔IgG/HRP二抗滴入，二氨基聯苯氨顯色處理，顯色后再以蘇木素染色，梯度乙醇處理后脫水，封片。觀察組織細胞結構變化，若結構依然完整，且發現棕褐色胞漿，胞核為藍色陽性；細胞結構完整但胞核為藍色，未見棕褐色胞漿，則胞核映襯下可見淺藍色，判定為陰性細胞。

檢測胎盤組織TLR 4的mRNA。組織標本置于冰盒，Trizol液研磨處理，將胎盤組織總RNA以Trizol一步法提取出來，逆轉錄得到cDNA，將TLR2、TLR4引物加入并誘導擴增。分別在94℃環境下處理5min、30 s，72℃環境下處理30 s、54℃環境下處理30 s，72℃延伸處理7min，進行PCR反應。參照2%瓊脂糖快速電泳β-actin，凝膠成像系統進行擴增產物分析。

1.3 診斷標準

參照第8版謝幸主編的《婦產科學》診斷胎膜早破[2]。胎膜組織病理檢查出現炎性反應，產前階段或分娩后24 h后測量體溫在37.5℃之上，有高于標準值的白細胞計數，惡露有臭味；胎膜病理檢測為炎性，即診斷為絨毛膜羊膜炎[3]。

1.4 統計方法

采用SPSS 16.0軟件對該研究的數據進行統計學的分析，計量資料用（x±s）表示，對比應用t檢驗，P＜0.05時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLR 4表達情況

2組TLR4胎盤表達情況以及胎盤TLR4 mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）；研究組血清IL-6、IL-8水平明顯高于對照組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 TLR 4表達與絨毛膜羊膜炎關聯

最終檢查發現組織絨毛膜羊膜炎23例，TLR4表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），TLR4mRNA水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者，組織絨毛膜羊膜炎者IL-6、IL-8水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 胎盤組織TLR4、IL-8水平與絨毛膜羊膜炎關聯（x±s）

2.3 該組胎膜組織病理檢查

組胎膜組織病理檢查確認為亞臨床型絨毛膜羊膜炎，均采用HE染色，圖1為Ⅰ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織，圖2為Ⅱ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織，圖3為Ⅲ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織，三期絨毛膜羊膜炎胎膜組織均呈現出陽性反應，且出現了急性炎性改變，Ⅰ期、Ⅱ、Ⅲ期改變逐漸明顯。

圖1 Ⅰ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織

圖2 Ⅱ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織

圖3 Ⅲ期絨毛膜羊膜炎胎膜組織

3 討論

生殖道病原微生物的上行性感染等因素會直接導致胎膜早破等現象的發生。國外學者提出，正常足月妊娠者胎盤免疫組化研究可見TLR2、TLR4正常表達，這是因為上述物質在分娩發動調節過程中發揮著一定的作用[4]，研究還發現，TLRs直接影響介導母體胎兒之間的天然免疫工作[5]。該研究為探討分析Toll受體4（TLR4）的表達與胎膜早破患者絨毛膜羊膜炎的關系，使用RTPCR技術以及免疫組化技術分別測定正常妊娠晚期以及胎膜早破孕婦胎盤組織TLR4mRNA表達情況以及蛋白表達特點，檢測結果發現，2組TLR4胎盤表達情況以及胎盤TLR4mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）；研究組血清IL-8水平明顯高于對照組差異有統計學意義（P＜0.05）。最終檢查發現組織絨毛膜羊膜炎23例，TLR4表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），TLR4 mRNA水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者，組織絨毛膜羊膜炎者IL-8水平高于無組織絨毛膜羊膜炎者差異有統計學意義（P＜0.05）。提示TLR4在正常妊娠情況下以及胎膜早破情況下有相似的胎盤組織表達特征，胎膜早破確實不是因單一因素產生的。

國外學者相關研究結果提出，合并絨毛膜羊膜炎孕產婦體內有高于正常情況的TLR2及TLR4表達現象，足月臨產、未臨產孕婦體內TLR2、TLR4mRNA水平測定結果顯示，臨產孕婦相比未臨產孕婦更高[6]。該研究數據結果與已有主要文獻結果基本一致。TLR2、TLR4表達水平均高于正常范圍，此種現象并沒有與胎膜完整性密切的相關性，但受到絨毛膜羊膜炎發生的直接影響，證實了TLRs作為先天性免疫重要組成部分的事實，提示宿主防御機制在抵抗感染方面十分重要[7]。

IL-8即中性粒細胞激活肽，其中包含72個氨基酸，為C-X-C家族細胞因子之一，有明顯的中性粒細胞激活與趨化作用，還直接參與并影響白細胞、內皮細胞黏附過程，有長于IL-8的半衰期，為重要的免疫調節因子、炎性介質，相比一般炎性介質有更高的特異性以及敏感性[8]。一旦發生絨毛膜羊膜感染現象，胎盤就會在刺激下激活TLR4、釋放IL-8，胎膜早破并絨毛膜羊膜炎與胎盤組織中IL-8的分泌以及TLR4的表達均有關聯，但目前尚不明確TLR4的內源性配體激活特征[9]。

該研究中，TLR4 mRNA及蛋白表達方面可能不甚準確，主要的影響因素包括TLR4的 mRNA及蛋白表達存在一些不同，mRNA相較蛋白合成半衰期更短，且mRNA是為絨毛膜、羊膜等細胞膜做準備，而蛋白表達則僅僅在羊膜羊皮細胞上完成；mRNA以大量18sRNA基因合成產生，蛋白表達僅僅是著色的羊膜細胞部分表達產生[10]。

綜上所述，TLR4上升以及IL-8上升均與絨毛膜羊膜炎有關聯，IL-8變化關系到胎膜完整性，對TLR4的監測是防控胎膜早破、絨毛膜羊膜炎的關鍵。TLR4在分娩調節中發揮著重要作用。TLR4的表達不僅在分娩的生理過程中發揮影響，TLR4的胎膜組織表達上調也是組織絨毛膜羊膜炎這個病理過程的影響因素。該研究樣本量較小，數據不及和不準確之處仍需進一步大范圍、精細研究進一步佐證，臨床上應當重視TLR4表達與妊娠分娩、宮內感染先天免疫作用，在臨床診療中充分利用該項指標的檢測分析與調控。

[1]薛會靈,劉金,梁玲，等.未足月胎膜早破產婦胎膜組織中TLR2表達變化及意義[J].山東醫藥,2014(18):8-9.

[2]薛會靈,劉金,梁義娟，等.未足月胎膜早破患者外周血單個核細胞TLR2mRNA水平變化及意義[J].山東醫藥,2014(24):32-33.

[3]曹耀輝.胎膜早破合并絨毛膜羊膜炎患者胎盤組織中TLR2的表達變化及意義[J].山東醫藥,2010(50):93-94.

[4]薛會靈,梁義娟,梁玲，等.胎膜中Toll樣受體2及受體4與胎膜早破的關系[J].國際婦產科學雜志,2014(2):194-196.

[5]曹耀輝.Toll受體4的表達與胎膜早破患者絨毛膜羊膜炎的關系[J].河北醫藥,2011,33(4):565-566.

[6]曹耀輝.胎膜早破患者胎盤組織中TLR2和TLR4的表達及與絨毛膜羊膜炎的關系[J].河北醫藥,2011,33(2):218-219.

[7]劉婷,陳衡,何春容，等.聯合檢測胎膜早破合并感染孕婦外周血C-反應蛋白及CD14+單核細胞表面TLR4表達的變化[J].中國保健營養，2012(5中旬刊):55-56.

[8]谷惠芳,戎小平,張煥改，等.TLR-4、TNF-α、IL-6與早產的關系及意義[J].臨床兒科雜志,2014(11):1039-1041,1047.

[9] Kacerovsky,M.,Andrys,C.,Hornychova,H，et al.Amniotic fluid soluble Toll-like receptor 4 in pregnancies complicated by preterMprelabor rupture of the membranes[J].The journal of maternal-fetal& neonatalmedicine,2012,25(7):1148-1155.

[10]TiMG.A.M.Wolfs,Boris W.Kramer,Geertje Thuijls，et al.Chorioamnionitis-induced fetal gut injury ismediated by direct gut exposure of inflammatory mediators or by lung inflammation[J].American Journal of Physiology,2014,306(3):G382-G393.

Investigation of the Relationship Between the Expression of Toll Receptor 4 and PreMature Rupture of Membranesw ith Chorioamnionitis

LIKai-xia1，LIU Fu-min2
1.Graduate School,Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu Province,221004 China;2.Huai'an Maternal and Child Health-care Center,Huai'an,Jiangsu Province,223300 China

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of Toll receptor 4(TLR4)and premature rupture ofmembraneswith chorioamnionitis.Methods30 caseswith premature rupture ofmembranes(study group)and 30 normal pregnant women in late pregnancy(control group)were selected.All the subjects underwent themeasurementof the positioning andexpression characteristics of placenta TLR4,and the level of IL-6 and IL-8,and postpartuMfetalmembrane pathology examination.ResultsTherewas no statistically significant difference in the expression of placenta TLR4 and the level of TLR4 mRNA between the two groups(P＞0.05).The level of seruMIL-8 wasmuch higher in the study group than in the control group(P＜0.05).The final check found that 23 cases with chorioamnionitis,no statistically significant difference in the expression level of TLR4 was found between the groups(P＞0.05).Chorioamnionitis patients had higher TLR4 mRNA level than patientswithout chorioamnionitis.Chorioamnionitis patients had higher IL-6 and IL-8 level than patients without chorioamnionitis(P＜0.05).PostpartuMfetalmembrane pathology examination identified subclinical chorioamnionitiswith stageⅢacute inflammatory changes and stageⅠ,Ⅱ,Ⅲgradually significant changes.ConclusionThe rise of TLR4 and IL-8 levels is associated with chorioamnionitis;changes of IL-8 are associated with fetalmembrane integrity;themonitoring of TLR4 is the key to preventing and controlling the incidence of premature rupture ofmembranes and chorioamnionitis.

Toll receptor 4;Expression;Premature rupture ofmembranes;Chorioamnionitis

R4.433

A

1674-0742（2015）07（a）-0001-03

2015-04-02）

表1 2組受試者胎盤組織TLR4、IL-6、IL-8水平[ng/L，（x±s）]

組別TLR4（陽性細胞數/mm2）TLR4 mRNA血清IL-6（ng/L）血清IL-8（ng/L）研究組（n=30）對照組（n=30）tP 10.4±2.4 9.1±1.1 0.248 0.892 0.842±0.005 0.702±0.012 1.009 0.482 0.048±0.16 0.027±0.09 14.558 0.005 0.098±0.24 0.58±0.12 19.528 0.002

李凱霞（1977.7-），女，江蘇淮陽人，本科，主治醫師，研究方向：婦產科。

劉福民（1958.10-），男，山東郯城人，碩士，主任醫師，研究方向：婦產科。