干旱脅迫下香蕉幼苗蛋白質組學分析

孫潔 龐昇澤 禤維言 馮斗

摘要：【目的】研究干旱脅迫下香蕉蛋白表達情況，為探索香蕉的抗旱分子機制提供理論依據。【方法】以桂蕉1號組培苗葉片為材料，對其進行干旱脅迫處理，運用iTRAQ結合液相色譜—質譜聯用（LC-MS-MS）技術對其差異蛋白進行檢測，并通過生物信息學分析對香蕉葉片蛋白質組進行鑒定。【結果】從干旱脅迫處理的組培苗葉片中共鑒定出1655種蛋白，其中獲得定量信息的蛋白有1023種，差異表達蛋白78種，包括上調蛋白32種和下調蛋白46種。GO生物進程分析結果表明，78種差異表達蛋白參與了細胞過程、代謝過程、響應刺激脅迫過程及單有機體過程等多個生物進程。GO分子功能分析結果表明，上調蛋白主要具有催化活性功能、結合功能、抗氧化活性和功能調節；下調蛋白主要具有催化活性功能和結合功能。GO富集分析結果顯示，上調蛋白主要參與過氧化氫反應、活性氧反應等；下調蛋白主要參與淀粉代謝、二糖代謝、蔗糖代謝、寡糖代謝、細胞碳水化合物生物合成等多個碳素代謝進程，且其主要是質外體、胞外區、類囊體等部位的組分，參與1，6-二磷酸果糖1-磷酸酶反應、蔗糖磷酸酶反應及碳水化合物磷酸酶反應等。在氮素代謝過程中，參與甘氨酸代謝的絲氨酸羥甲基轉移酶（SHMT）在線粒體中的含量明顯下降，而參與活性氧代謝的過氧化氫酶（CAT）含量明顯上升。【結論】干旱脅迫下香蕉的表達蛋白種類及數量發生明顯變化，且其抗旱機制是多種蛋白質共同作用的結果，主要通過調節物質和能量代謝及應激活動來發揮作用。

關鍵詞： 香蕉；干旱脅迫；差異表達蛋白；iTRAQ；液相色譜—質譜聯用（LC-MS-MS）技術

中圖分類號： S668.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）12-2020-07

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to study protein expression of banana under drought stress，in order to provide theoretical basis for molecular mechanism of drought resistance in banana. 【Method】Tissue-cultured seedlings of Guijiao 1 were treated by drought stress. Then differentially expressed proteins in leaf of banana were detected using iTRAQ and liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS-MS） technology， and identified based on bioinformatics analysis. 【Result】A total of 1655 proteins were identified from leaves of tissue-cultured seedlings treated by drought stress， 1023 of which were quantified， but only 78 differentially expressed proteins were found， including 32 up-regulated proteins and 46 down-regulated proteins. The gene ontology（GO） annotation and analysis of biological processes showed that， 78 differentially expressed proteins were mainly involved in multiple biological processes， such as cellular process， metabolic process， response to stimulus and single-organism process. GO annotation and analysis of molecular function indicated that， the up-regulated proteins mainly had catalytic activity， binding function， antioxidant activity and molecular function regulation， while the down-regulated proteins mainly had catalytic activity and binding function. GO enrichment analysis showed that， the up-regulated proteins were mainly involved in reactions with hydrogen peroxide and reactions with reactive oxygen， the down-regulated proteins were mainly involved in many carbon metabolism processes，including starch metabolism， disaccharide metabolism， sucrose metabolism， oligosaccharide metabolism and cellular carbohydrate biosynthesis， and which were constituents of apoplast and extracellular region， thylakoid and so on， and mainly involved in reactions catalyzed by fructose-1，6-diphosphate 1-phosphatase， sucrose phospholylase， carbohydrate phospholylase. In several nitrogen metabolism process， content of serine hydroxymethyl transferase（SHMT） involved in glycine metabolism declined obviously in mitochondria， however， varieties of catalase（CAT） involved in reactive oxygen metabolism rose obviously. 【Conclusion】Under drought stress， kinds and amounts of expressed proteins in banana leaf change obviously， mechanism of drought resistance is result of interactions between various proteins， and primarily plays an role by regulating substance metabolism， energy metabolism and stress response.

Key words： banana； drought stress； differentially expressed protein； iTRAQ； liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS-MS） technology

0 引言

【研究意義】干旱是影響植物生長發育最主要的逆境因子，每年由于干旱脅迫給農業造成的損失相當于其他所有環境因子脅迫造成損失的總和（孫存華等，2005）。干旱脅迫下，植物生長發育受到不同程度的影響，植物基因表達發生改變，如與抗性相關的基因被誘導表達上調，但還有部分基因的轉錄或翻譯過程受到抑制甚至關閉，導致其編碼的蛋白無法正常合成（申永鋒等，2007）。因此，干旱脅迫下差異蛋白質組學研究對闡明脅迫傷害機制及植物響應機制具有重要意義。【前人研究進展】Salekdeh等（2002）利用雙向電泳技術檢測干旱脅迫下水稻葉片蛋白，結果發現42種差異蛋白，其中多個參與抗氧化反應、光合作用、能量代謝和細胞骨架等過程。張潔等（2007）在冬小麥抗旱性研究中發現66.2 kD的D-應答蛋白，將該蛋白作為抗旱性鑒定指標。Xu和Huang（2010）對兩種匍匐翦股穎進行干旱處理，對其葉片蛋白進行雙向電泳，共鑒定出46種蛋白質，并發現一些參與基礎碳氮循環的蛋白質豐度均有所下降，而抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽轉移酶（GST）等抗氧化酶蛋白豐度上升，表明一些參與細胞膜合成、細胞壁松動、抗氧化防御及維持細胞膨壓的蛋白在多年生草響應水分脅迫中發揮重要作用。Aranjuelo等（2011）從植物生理學和蛋白質組學水平研究了苜宿葉片對干旱脅迫的響應，結果發現干旱脅迫導致葉片中Rubisco結合蛋白含量下降，蛋白酶表達上升，Rubisco蛋白被降解，致使Rubisco衍生的氮素用于脯氨酸等滲透調節物質合成，并向主根輸送，以提高植株抗旱性，其次，干旱脅迫誘導Rubisco的降解，利用Rubisco衍生的氮素彌補根瘤固氮酶固氮量的不足，可能是苜宿適應干旱脅迫的另一種途徑。目前，已有大量研究證實干旱對香蕉的品質和產量有較大影響，但有關香蕉抗旱性的研究主要集中在光合作用（黃鶴麗等，2009a）、膜系統（黃鶴麗等，2009b）、滲透調節、植株形態（王蕊等，2010）、酶活性（劉晚茍和吳華偉，2011）、激素調節（何娟等，2013）等方面。此外，對香蕉抗旱基因ASR（王園，2010）、MaASR1（張麗麗，2012；苗紅霞等，2014）和MaMYB（邢文婷，2014）等也進行了深入研究。【本研究切入點】目前，鮮見有關香蕉在干旱脅迫下差異蛋白質組學的文獻報道。【擬解決的關鍵問題】采用iTRAQ結合液相色譜—質譜聯用（LC-MS-MS）技術對干旱脅迫下香蕉蛋白表達情況進行研究，從蛋白質水平上對香蕉的抗旱分子機理進行探討，以期為香蕉抗旱育種提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為桂蕉1號組培苗，由廣西農業科學院提供。iTRAQ Kit購自AB SCIEX公司；測序級胰蛋白酶購自Promega公司；乙醇、丙烯腈、乙腈購自Fisher Chemical公司；三氟乙酸購自Sigma-Aldrich公司；2D-Quant Kit定量試劑盒購自GE Healthcare公司。主要儀器設備：Q Exactive質譜儀（Thermo ScientificTM公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 干旱脅迫處理 取長勢健壯均一的6葉1心期杯栽香蕉組培幼苗，移栽至大桶中進行盆栽培養，土壤選用當地具有代表性的紅壤，在土壤相對水含量80%～70%的條件下培養40 d后，設置80%～70%（T1，對照）、70%～65%（T2）、65%～60%（T3）、60%～55%（T4）、55%～50%（T5）5個土壤水分處理，每處理4個重復，干旱脅迫處理10 d，采集組培幼苗倒2葉，將處理組T2、T3、T4和T5的葉片混合后取樣用于后續試驗（Yang et al.，2012）。

1. 2. 2 蛋白質提取 取混合的香蕉組培苗葉片0.5 g，液氮下研磨成粉，加入4倍體積裂解液（8 mol/L尿素，1% TritonX-100，65 mmol/L DTT，0.1%蛋白酶抑制劑），冰上超聲處理3次；于4 ℃ 20000×g離心10 min，取上清液；加入適量預冷的15%TCA丙酮溶液，-20 ℃沉淀2 h；于4 ℃ 20000×g離心10 min，棄上清液；預冷丙酮洗滌，3次重復；復溶于含0.1 mol/L TEAB的緩沖液中。最后，使用2D-Quant Kit定量試劑盒進行蛋白質定量。

1. 2. 3 iTRAQ定量 每處理取100 μg蛋白質，胰蛋白酶消化后，肽段用Strata X C18 SPE柱脫鹽，分別用分子質量為117和118的基團標記對照組，分子質量為119和121的基團標記處理組。

1. 2. 4 數據庫檢索 通過Q Exactive質譜儀獲得MS-MS質譜信息，利用Mascot Search Engine在Uniprot_ Musa acuminata數據庫中進行信息搜索。

2 結果與分析

2. 1 差異表達蛋白鑒定結果

利用Uniprot_Musa acuminata數據庫共鑒定出1655種蛋白，其中獲得定量信息的蛋白1023種。蛋白相對定量比值高于1.30或低于0.77，當t檢驗值P小于0.05時，共獲得78種差異表達蛋白（上調蛋白32種，下調蛋白46種），其中，已鑒定出具體名稱的差異表達蛋白8種（表1）。利用Uniprot_Musa acuminata數據庫對已鑒定出的8種差異表達蛋白進行分析，結果發現位于香蕉葉片細胞線粒體上的絲氨酸羥甲基轉移酶（SHMT）含量明顯下降，由于其主要參與N5，N10-亞甲基四氫葉酸+絲氨酸+H2O→四氫葉酸+L-絲氨酸反應過程，會直接導致L-絲氨酸含量下降，而L-絲氨酸是生命活動必需物質，因此干旱脅迫下香蕉幼苗生命活動受到明顯抑制。此外，線粒體SHMT具有離子結合、一碳基團轉移、輔因子結合等分子功能，主要參與非生物脅迫的響應刺激、細胞代謝、有機物質代謝等生物進程，由此證實香蕉幼苗抗旱機制具有多樣性。

2. 2 GO生物進程分析結果

運用DAVID數據庫對篩選獲得的32種上調蛋白和46種下調蛋白進行GO生物進程分類，其中22個上調蛋白和32個下調蛋白能找到對應的分類號。分析結果如表2所示，已注釋生物進程的上調蛋白主要參與響應刺激脅迫過程（GO：0050896）、細胞過程（GO：0009987）、代謝過程（GO：0008152）及單有機體過程（GO：0044699），還涉及發育過程（GO：0032502）、多細胞有機體過程（GO：003250）、細胞定位（GO：0051179）、多有機體過程（GO：0051704）、細胞組分組織發生（GO：0071840）及生物學調節（GO：0065007）等生物學進程，其中響應刺激脅迫過程和細胞過程類別所占差異表達蛋白的比例較大，分別占上調差異表達蛋白總數的24.14%和17.24%；已注釋生物進程的下調蛋白主要參與細胞過程（GO：0009987）、代謝過程（GO：0008152）、單有機體過程（GO：0044699）及響應刺激脅迫過程（GO：0050896），還涉及生物學調節（GO：0065007）、多有機體過程（GO：0051704）及細胞組分組織發生（GO：0071840）等生物學進程，其中細胞過程類別和代謝過程類別所占差異表達蛋白的比例較大，分別占下調蛋白總數的25.23%和22.43%。

綜合分析發現，參與細胞過程和代謝過程類別的總差異表達蛋白數量較多，分別為37和33種；參與光合電子傳遞鏈的差異表達蛋白共3種，占細胞過程類別差異表達蛋白總數的8.11%；參與光合作用的差異表達蛋白共10種，占代謝過程類別差異表達蛋白總數的30.30%，表明在干旱脅迫下香蕉幼苗的光合作用受影響較大。此外，參與淀粉代謝、二糖代謝、蔗糖代謝、寡糖代謝、細胞碳水化合物生物合成、葡聚糖代謝和多糖代謝的差異表達蛋白均為3個，分別占代謝過程類別差異表達蛋白總數的8.11%，表明干旱脅迫對香蕉體內的能量和物質轉化有較大影響，且影響范圍較大。此外，研究還發現，共有14種上調蛋白和16種下調蛋白參與了香蕉的響應刺激脅迫過程且發生變化，表明受到干旱脅迫時，香蕉體內的蛋白質應激性機制反應明顯。

2. 3 GO分子功能分析結果

運用DAVID數據庫對篩選獲得的32種上調蛋白和46種下調蛋白進行GO分子功能分類，其中28種上調蛋白和46種下調蛋白能找到對應的分類號。分析結果如表3所示，已注釋分子功能的上調蛋白主要具有催化活性功能（GO：0003824）、結合功能（GO：0005488）、抗氧化活性（GO：0016209）和功能調節（GO：0098772），少數蛋白具有結構分子活性（GO：0005198）與轉運活性（GO：0005215），其中催化活性功能和結合功能所占比例較大，均占上調差異表達蛋白總數的38.46%；已注釋分子功能的下調蛋白主要具有催化活性功能（GO：0003824）和結合功能（GO：0005488），少數蛋白具有電子載體活性（GO：0009055），其中催化活性功能和結合功能所占比例較大，分別占下調差異表達蛋白總數的50.82%和40.98%。因此，具有催化活性功能和結合功能的差異表達蛋白分別占差異表達蛋白總數的47.13%和40.23%。其中具有輔因子結合功能的差異表達蛋白有9種，占結合功能類別差異表達蛋白總數的22.50%。表明干旱脅迫對香蕉幼苗葉片中酶活性有較大影響，進而影響其正常的生理代謝活動。

2. 4 GO富集分析

運用DAVID數據庫對篩選獲得的32種上調蛋白和46種下調蛋白進行GO富集分析。其中，對上調蛋白進行生物進程GO富集分析結果如圖1-A所示，其主要參與過氧化氫反應（GO：0042542）和活性氧反應（GO：0000302）等，表明干旱促使香蕉幼苗葉片中H2O2等活性氧有害物質含量上升，進而引起香蕉幼苗體內CAT含量上升，從而形成新的響應機制。對下調蛋白進行生物進程、細胞組分、分子功能的GO富集分析，結果如圖1-B所示。其中，生物進程的富集分析結果顯示，下調蛋白主要參與淀粉代謝（GO：0005982）、二糖代謝（GO：0005984）、蔗糖代謝（GO：0005985）、寡糖代謝（GO：0009311）、細胞碳水化合物生物合成（GO：0034637）等過程。細胞組分的富集分析結果顯示，下調蛋白主要位于質外體（GO：0048046）、胞外區（GO：0005576）及類囊體（GO：0009579）等部位。分子功能的富集分析結果顯示，下調蛋白主要參與1，6-二磷酸果糖1-磷酸酶反應（GO：0042132）、蔗糖磷酸酶反應（GO：0050308）及碳水化合物磷酸酶反應（GO：0019203）等。綜上所述，干旱脅迫下，香蕉幼苗葉片中參與物質代謝和能量循環的蛋白質表達量明顯下降。

3 討論

iTRAQ技術是美國應用生物系統公司于2004年推出的一項新的同位素標記技術（Ross et al.，2004），為低豐度蛋白定性和定量研究提供了有效的方法。大量研究證實，運用iTRAQ結合LC-MS-MS技術可同時分離和鑒定成百上千的蛋白質，最大程度地得到蛋白質組的“全組信息”（王林纖等，2010），并能發現一些低豐度的差異表達蛋白。本研究共鑒定出1655種蛋白，其中已獲得定量信息的蛋白1023種，差異表達蛋白78種，高于利用雙向電泳技術在香蕉葉片中檢測出的差異表達蛋白數量（祁君鳳，2010）。

GO注釋是一個重要的生物信息學分析方法，用于統一表示基因和基因產物在所有物種中的屬性，其原理就是通過計算機程序建立基因產物與用于定義它們的本體論詞條間的聯系（黃子夏等，2012）。1998年，基因本體論項目（Gene Ontology Project）被創立（Harris et al.，2004），該項目對基因功能進行了一致性描述，開發了可控制的詞匯表，且無物種特異性。秦志英（2013）運用iTRAQ技術分離和鑒定了BNS不育系在不育條件和可育條件下花藥不同發育時期的蛋白質，從細胞組分、分子功能和生物進程3個方面進行GO注釋和分析，結果顯示83種差異表達蛋白中有56種具有生物學途徑GO注釋。本研究中，主要從生物進程和分子功能兩個方面進行分析注釋。生物進程的GO分類結果顯示，差異表達蛋白參與了香蕉幼苗葉片中的響應刺激過程、細胞過程、代謝過程、單有機體過程、生物學調節、多有機體過程和細胞組分組織發生過程等生物進程。由此推斷，在干旱脅迫下，香蕉幼苗葉片中的應激機制啟動，通過生長環境與體內代謝活動的相互作用，經過多重生物進程的改變，將干旱脅迫帶來的損失降到最低。此外，王忠（2000）和張仁和等（2011）研究表明，抗旱玉米品種具有較高的電子傳遞效率，其是抗旱的光合特征之一，干旱脅迫能降低植物的光合速率及葉綠體對光能的吸收能力和轉化效率，也能降低光合電子傳遞速率和磷酸化活力，從而影響光合碳同化。本研究也發現，參與光合電子傳遞鏈和光合作用的差異表達蛋白分別有3種和10種，分別占細胞過程類別差異表達蛋白總數的8.11%和代謝過程類別差異表達蛋白總數的30.30%，表明在干旱脅迫下，香蕉幼苗的光合作用受影響較大。

本研究在已鑒定的蛋白中發現了線粒體SHMT，其含量在干旱脅迫下明顯降低，直接影響絲氨酸轉化過程，導致香蕉無法正常生長發育。Bauwe和Kolukisaoglu（2003）研究發現，SHMT在高等植物的一碳代謝和光呼吸中發揮重要作用，主要功能是在蛋白質和嘌呤的生物合成中提供甘氨酸，并為C1庫提供N5，N10-亞甲基四氫葉酸。若植物缺少SHMT會導致嚴重的生長遲緩（馬莉和陳麗梅，2008），可見SHMT在植物中具有重要的生理功能。目前，GenBank數據庫中已收錄了35種以上的SHMT序列，其在香蕉體內的作用機理需進一步探究。此外，本研究還發現，干旱脅迫可引起香蕉幼苗葉片中H2O2等活性氧有害物質含量上升，導致CAT含量的增加，表明香蕉自身存在調控應激機制，對干旱脅迫具有一定的抵抗力。由此推測，植物的抗旱機制可在一定程度上緩解干旱脅迫帶來的傷害，如高粱以CAT為主要抗氧化酶，具有較強的抗旱、傷害修復及超補能力，水分脅迫下高粱CAT活性明顯增加（邵艷軍，2006）。但不同植物的抗旱機制存在差異，仍需進一步探究。

4 結論

干旱脅迫下香蕉的表達蛋白種類及數量發生明顯變化，且其抗旱機制是多種蛋白質共同作用的結果，主要通過調節物質和能量代謝及應激活動來發揮作用。

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（責任編輯 陳 燕）