MS營養成分對橡膠樹幼態微型芽條培育的影響

桂明春 李玲 管艷 王亞 田海 梁國平

摘 要 為了探索基本培養基中各營養成分對橡膠樹幼態微型芽條培育的影響情況，以橡膠樹優良無性系‘云研73-477花藥體胚植株為外植體，采用正交試驗法研究了MS營養成分對橡膠樹幼態微型芽條培育的影響。結果表明：以莖段為外植體培育幼態微型芽條時，MS培養基中4種營養成分對誘導率的影響均不顯著；大量元素、有機成分及鐵鹽對繁殖系數的影響差異極顯著；微量元素、有機成分及鐵鹽對死亡率的影響差異極顯著，理論上最優組合為全量大量元素+4/5微量元素+全量有機成分+全量鐵鹽；以莖尖為外植體培育幼態微型芽條時，培養過程中，外植體無死亡現象發生，均有新芽產生；大量元素、微量元素及鐵鹽對繁殖系數的影響差異極顯著，而有機成分不顯著，理論上最優組合為2/5大量元素+2/5微量元素+4/5有機成分+全量鐵鹽。

關鍵詞 橡膠樹；MS；幼態微型芽條；誘導率；繁殖系數

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract Apex and nodal cuttings of rubber variety Yunyan 73-477 were taken as the explants， and the effects of MS elements on in vitro culture of micro-shoots were studied by an orthogonal experiment. The results showed that the effects of 4 elements in MS on the inductive rate were not significantly different at 0.05 level when nodal cuttings were selected as in vitro micro-shoots， while macronutrients， organic nutrients and iron salt had significant effects on both multiplication rate and death rate at 0.01 level. The optimum combination was macronutirents+4/5 micronutrients + organic nutrients + iron salt. No explants death was observed during culture when apex was selected as in vitro micro-shoots and all explants sprouted. The effects of macronutrients， micronutrients and iron salt on the propagation coefficient were significantly different at 0.01 level， whereas it was not significant in organic nutrients. The optimum combination was 2/5 macronutrients + 2/5 micronutrients + 4/5 organic nutrients + iron salt.

Key works Hevea brasiliensis； MS elements； Micro-shoots； Inductive rate； Multiplication rate

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.001

目前，天然橡膠生產中，老態芽接無性系因其能保持母樹干膠產量相對較高的特性而被廣泛作為植膠材料[1]。但其生長慢，經濟壽命短，抗逆性差，適應性小[2]，在一定程度上制約了天然橡膠產業的發展。幼態芽接無性系較老態芽接無性系生長速度快，干膠產量高，僅次于自根幼態無性系[1]，據此，在自根幼態無性系還不能滿足大面積推廣種植之前，推廣應用幼態芽接無性系，無疑是一種提升天然橡膠產業的有效途徑[3]。目前，幼態芽接無性系的培育技術已趨成熟[1]，該技術將離體培養的橡膠樹幼態微型芽條和籽苗芽接技術結合起來，不僅解決了籽苗芽接操作過程中由接穗與砧木大小不匹配所造成的困難，提高芽接成活率，且在芽接操作時，不必剖離芽片的木質部，使芽接速度顯著提高。但目前適合云南植膠區優良品種的幼態微型芽條的培育技術尚未成熟[4]，尚不能為幼態芽接無性系的培育提供足量優質芽條。因此，培育云南優良橡膠樹品種的幼態微型芽條已迫在眉睫。

橡膠樹一直被認為是組織培養中難度較大的樹種之一[5]，且對基因型的依賴性大[6]。經過橡膠樹研究者的多年努力，目前已取較大進展[5-6]，在橡膠樹莖尖及莖段方面亦取得較大成果，1998年，陳雄庭等[7]對橡膠樹品種熱研88-13、海墾2、大豐95等花藥植株的微繁進行研究，并取得較大進展。隨后，趙輝等[8]、鄧柳紅等[9]、孫小龍等[10]、桂明春等[11-12]均對橡膠樹莖尖及莖段組織培養進行研究，亦取得一定的進展。但這些研究多側重于培養基中激素及培養條件的探索。而未見有關培養基中營養成分影響的詳細報道。據此，本試驗以橡膠樹優良無性系‘云研73-477花藥體胚植株的莖段及莖尖為外植體，著重研究MS培養基中各營養成分對橡膠樹幼態微型芽條培育的影響，以期為培育橡膠樹幼態微型芽條提供理論依據，為橡膠樹幼態芽接無性系的推廣應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗時間、地點 試驗于2015年4～12月在云南省熱帶作物科學研究所橡膠研究中心進行。

1.1.2 材料 以橡膠樹優良無性系‘云研73-477花藥體胚植株為供試材料。

1.1.3 試驗儀器 數顯游標卡尺（中國桂林，廣陸牌，精度0.1 mm）。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 以MS培養基中大量元素（A）、微量元素（B）、有機成分（C）及鐵鹽（D）為試驗因子，忽略因子間交互作用，按L9（34）正交試驗表進行，各因子水平及濃度配比見表1、2。額外附加0.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L IBA、0.2 mg/L IAA、0.5 mg/L GA3，60 g/L蔗糖，5.5 g/L瓊脂。

1.2.2 試驗方法 按桂明春等[4]報道的接種方法進行接種，3次重復。每支試管分裝培養基35 mL，用帶有透氣膜的塑料蓋封口，pH值為5.8～6.2。光照時間為10 h/d，光照強度為1 500 lx，培養溫度為（26±0.5）℃。

1.2.3 數據統計與分析 試驗過程中，每隔1周觀察芽的誘導及生長情況，并作詳細記錄。培養45 d時統計各處理的有芽外植體節數、死亡外植體節數及不定芽數，根據桂明春等[9]的計算公式分別算出外植體的死亡率、芽的誘導率及繁殖系數。并用DPSv7.05版數據處理系統進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 MS營養成分對莖段幼態微型芽條培養的影響

培養約1周后，部分莖段的腋芽開始萌動，培養至2周時，絕大部分莖段的腋芽已萌動。繼續培養，萌動芽逐漸伸長發育成新芽，新芽進一步伸長發育成5～8 cm的幼態微型芽條。在試驗過程中發現，由莖段產生的新生芽有3類，I類新生芽：一個葉腋只抽出一個新芽，芽粗大，發育良好，能伸長形成芽條（圖1-A）；II類新生芽：一個葉腋只抽出一個新芽，發育較差，嫩葉卷曲，不能進一步伸長發育成芽條（圖1-B）；III類新生芽：一個葉腋同時抽出2個或多個新芽，只有一個新芽粗大，發育良好，能伸長形成芽條，其余新芽發育較差，不能發育成芽條（圖1-C）（圖2）。

表3說明，MS營養成分對莖段幼態微型芽條培育中各指標的影響不同，相對于誘導率來說，4種成分的影響差異均不顯著；對于繁殖系數來說，大量元素、有機成分及鐵鹽的影響差異達極顯著水平，微量元素則不顯著；對于死亡率來說，微量元素、有機成分及鐵鹽的影響差異達極顯著水平，大量元素則不顯著。因此，本實驗將繁殖系數和死亡率作為篩選適合莖段幼態微型芽條培育的MS培養基成分比例的重要指標，現對兩個指標作進一步直觀分析，結果見表4。

表4說明，MS培養基各營養成分對繁殖系數和外植體死亡率的影響主次順序和優水平存在差異。相對于繁殖系數而言，因子主次順序為A>C>D>B，即大量元素的影響最大，有機成分次之，微量元素最小，最優組合為A1B1C1D1；而對外植體死亡率來說，因子主次順序為B>D>C>A，即微量元素的影響最大，鐵鹽次之，大量元素最小，最優組合為A3B2C2D1。

但上述分析并不能得出適合莖段幼態微型芽條培育適宜MS培養基各成分比例，需對單個因子進行逐一分析。相對于D因子來說，繁殖系數和外植體死亡率的優水均是水平1，故D因子的優水平是D1；相對于A因子來說，繁殖系數的優水平為A1，外植體死亡率的優水平是A3，兩者的優水平不一致，但A因子對繁殖系數的影響差異達極顯著水平，而對死亡率的影響則不顯著（表3），故A因子的優水平為A1；同理得B因子和C因子的優水平分別為B2、C1。

綜上所述，理論上適合橡膠樹莖段幼態微型芽條培育的最優組合為A1B2C1D1，即全量大量元素+ 4/5微量元素+全量有機成分+全量鐵鹽。

2.2 MS營養成分對莖尖幼態微型芽條培養的影響

試驗中發現，在試驗所設的9個處理中，莖尖的頂芽和葉腋均可萌動發育成新芽，培養過程中，外植體無死亡現象發生，均有不定芽產生，誘導率為100%，死亡率為0，且每節外植體均產生多個新芽。據此，將新芽的繁殖系數作為分析MS營養對莖尖幼態微型芽條培育的考核指標，現對其進行統計分析，結果見表5、表6。

表5說明，MS培養基中大量元素、微量元素及鐵鹽對繁殖系數的影響差異達極顯著水平，有機成分的影響則不顯著。

由直觀分析可知（表6），繁殖系數在組合間存在的差異較大，最高達6.22倍，最小僅為1.36倍，兩者間的差異極顯著；由極差R值的大小順序可知，4個因子的主次順序為A>D>B>C，即大量元素的影響最大，鐵鹽次之，有機成分最小，這與方差分析的結果一致，優組合為A3B3C2D1，即2/5大量元素+2/5微量元素+4/5有機成分+全量鐵鹽。

表6還表明，MS培養基中4個營養成分比例的改變，繁殖系數的變化存在一定的差異，在試驗所設的范圍內，大量元素及微量元素比例的降低，繁殖系數隨之增加；而有機成分比例降低時，繁殖系數呈先增加后降低趨勢，當有機成分的比例為4/5時，繁殖系數達最大值（3.23倍），有機成分增加或降低均會使繁殖系數降低；鐵鹽用量的降低，繁殖系數隨之降低，當MS培養基中添加全量鐵鹽時，繁殖系數達最大值（4.17倍）。

3 討論

MS基本培養基是一種在植物組織培養中應用較廣的基質配方，是由Murashige 和Skoog于1962 年為培養煙草細胞而設計的。因其硝酸鹽、鉀離子和銨離子含量較其它培養基豐富，微量元素和有機成分全面而被廣泛使用[13]。也是橡膠樹組織培養所通用的培養基。但不同類型材料離體培養所需的MS培養基成分比例不同，陳雄庭等[1]認為誘導花藥愈傷組織的基本培養基MB的效果比MS好。黃德貴等[14]也認為MB的誘導效果較好。譚德冠等[6]認為將MS培養基中微量元素增大1倍可大大提高胚狀體的誘導率，將大量元素降至80%，微量元素加倍可提高植株的再生頻率。本試驗結果表明，分別以體胚植株的莖段和莖尖為外植體培育幼態微型芽條，兩者所需的MS培養基營養成分比例亦不同，前者適宜比例為全量大量元素+4/5微量元素+全量有機成分+全量鐵鹽；后者適宜比例為2/5大量元素+2/5微量元素+4/5有機成分+全量鐵鹽。據此，在橡膠樹幼態微型芽條培育中，應根據不同類型的材料來選擇適合的MS培養基營養成分的比例。

在橡膠樹幼態微型芽條培育中，首要解決的問題是誘導出具有伸長能力的新芽，這類芽能否誘導成功直接關系到微型幼態芽條培育的成敗[4]。本試驗所設的9個處理中，均有一定數量的新芽產生，但大部分芽的質量較差，不易進一步伸長發育形成可用芽條，而是在后續的培養過程中逐漸枯萎死亡或從芽的基部長出許多小芽形成簇生芽，簇生芽不能進一步伸長發育成可用芽條。由此可見，高質量新芽誘導技術的不成熟已嚴重制約了橡膠樹幼態微型芽條的培育，是目前急需解決的技術問題之一。此外，MS培養基的4種營養成分包括多種化學物質，如大量元素包括NH4NO3、KNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4和CaCl2·2H2O或CaCl2。本試驗已找出了MS培養基中營養成分對莖尖及莖段微型芽條培育的影響規律，并篩選出了最佳比例，但對各營養成分中具體化學物質的影響情況未做深入研究。王樹昌等[15]認為微量元素Cu對橡膠樹組培培養成胚、生根及組培苗生根有著重要影響。因此，MS培養基中4種營養成分種各化學物質對橡膠樹幼態微型芽條培育的影響有待進一步研究。

參考文獻

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