SSR和AFLP分子標記鑒定巴西橡膠樹種質資源的比較研究

鐘淦彬 李維國 位明明 鄭學項 易曉潔

摘 要 選用178份巴西橡膠樹種質材料，采用SSR和AFLP分子標記技術對巴西橡膠樹種質資源進行鑒定，探討2種方法的應用效果并加以比較分析。結果顯示：利用多態性強的19對SSR引物，檢測到92個等位基因；用25對AFLP引物組，檢測到702條有多態性的帶。SSR位點的平均多態性信息量（PIC）值為0.46，而AFLP多態性帶比例是54.88%，AFLP比SSR分子標記具有更高的多態性。結果說明，AFLP標記比SSR標記更適合于巴西橡膠樹種質材料的鑒定和保護，同時進一步驗證了在作物遺傳資源的研究中，采用多種分子標記方法可以獲得更加準確的研究數據。

關鍵詞 巴西橡膠樹；SSR；AFLP；分析比較

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract The 178 rubber tree germplasm resources were identified using SSR and AFLP markers and to explore the application effects of two methods by comparing the result of two markers. The results showed that 19 pairs of SSR primers， total 92 polymorphic fragments were detected； 25 AFLP primer combinations（Ecor I/Mse I）were used， and total 701 polymorphic bands were produced. AFLP was higher polymorphic than SSR. The average of polymorphic information content（PIC）was 0.46 for SSRs. Percentage of polymorphic AFLP bands was 54.88%. According to the comparative result acquired in this study， AFLP is more suitable for rubber tree germplasm materials identification and protection than SSR. Meanwhile further validated that in crop genetic resources research， use more kinds of molecular marker method can obtain more accurate data.

Key words Hevea brasiliensis； SSR； AFLP； Comparative analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.002

20世紀90年代以來，基于PCR技術的分子標記逐步發展起來，如SSR、AFLP等，被廣泛應用于動植物種質資源研究。SSR（Simple Sequence Repeats）簡單重復序列，最常見是雙核苷酸重復，由于串聯數目的不同產生其高度的多態性，也稱微衛星DNA。SSR檢測所需DNA量少，試驗操作簡便，穩定性好[1]。AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）擴增片段長度多態性，1992年荷蘭Keygene公司科學家Zabeau Mare和Vos Pieter發明并發展起來的一種分子標記方法，是基于PCR技術擴增基因組DNA限制性片段。其重復性強，可靠性好，可信度高，雖然實驗成本較高，但也越來越廣泛地應用在遺傳育種研究領域。進入21世紀以來，分子標記也逐步被應用在橡膠樹種資資源的研究中，Saha等[2]用（hmct5、hmct1、hmac4、hmac5）4個SSR標記鑒定了27份橡膠樹種質；謝黎黎等[3]用SSR標記構建了87份橡膠樹材料的DNA指紋圖譜；2007年，王惠君[4]構建了橡膠樹初級分子遺傳圖譜；2010年，龍青姨[5]利用EST～SSR標記研究橡膠樹栽培種質的遺傳多樣性與遺傳分化，鐘淦彬[6]利用AFLP分子標記方法構建了部分橡膠樹種質資源的AFLP指紋圖譜。

本試驗選用178份巴西橡膠樹種質材料，分別采用SSR標記與AFLP標記技術對這些種質材料進行鑒定，探討2種標記技術的應用效果并加以比較分析。其試驗結果可以初探分子標記技術在研究巴西橡膠樹種質資源上的作用，理論與實際應用的驗證，為進一步使用標記技術研究橡膠樹種質材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

在海南省儋州市中國熱帶農業科學院國家橡膠樹種質圃中，采摘24號組合[6]淡綠期橡膠樹幼葉， 放入冰壺，帶回實驗室后用清水沖洗吸干，置于超低溫冰箱（-70 ℃）保存備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采取改良CTAB法進行橡膠樹葉片基因組DNA的提取。具體步驟參照相關文獻進行[7]。

1.2.2 SSR引物選擇與分析 SSR標記所用的19對引物全部來源于Feng等[8-9]，所用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

SSR分析參照鄭學項等[10]的方法。PCR反應采用20 μL體系，具體含量：2×Taq Master Mix 3.86 μL；正向引物、反向引物各0.25 μL；DNA模板2.5 μL；去離子水13.14 μL。PCR擴增反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，52～57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存20 min。獲得橡膠樹葉片DNA擴增產物。

采用8%非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳，電泳緩沖液為1×TBE，100 V恒壓電泳1.5～2 h。電泳結束后，采用快速銀染法染色，按照張軍等[11]的方法。

1.2.3 AFLP引物選擇與分析 AFLP標記所用的25對引物全部來源于鐘淦彬等[6，12]，所用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

AFLP分析參照Vos等[13]、王惠君等[14-15]報道的方法進行。提取總DNA，再進行酶切、連接、預擴增、以及選擇性擴增。最后，使用銀染法對橡膠樹DNA擴增產物進行檢測與分析，具體參照陸光遠等[16]的方法。

1.3 數據整理與分析

把橡膠樹種質的電泳譜帶轉換成Excel表格數字模式。電泳譜帶中，在相同的遷移位置上有帶的計為1，無帶的計為0，完成1與0的Excel表格，使用軟件編輯器轉換形成統計軟件可以識別的數據模塊，SSR標記中形成19對引物的數據矩陣，AFLP標記中形成25對引物的數據矩陣，接著采用Ntsys～pc2.lla（NTsys：Nurnerieal Taxonomy and Multivariate Analysis System）軟件[17]進行數據處理，獲得UPGMA聚類樹狀圖，分別為SSR標記UPGMA聚類樹狀圖和AFLP標記UPGMA聚類樹狀圖，然后通過這2個聚類樹狀圖進行橡膠樹種質材料的聚類分析與親緣關系分析。最后采用Smith等[18]的方法計算標記位點的多態性信息量PIC值（Polymorphism information content），即：PIC=1～∑fi2，其中fi2為i位點的基因頻率。

2 結果與分析

2.1 引物多態性分析

2.1.1 SSR分析 引物HBE190對部分橡膠樹種質的SSR指紋圖譜見圖1，所用的19對SSR引物擴增結果見表1。

對所有的橡膠樹種質材料，應用多態性強的19對引物組合[8～9]進行多態性擴增，獲得了供試材料的SSR指紋圖譜。分析圖譜獲得如下結果：引物組合多態信息含量在0.095～0.669之間，多態性最好的引物是HBE 329，最差的是HBE 090；引物的多態性條帶數在2～7之間，平均達4條，引物HBE 084、HBE 126、HBE 192、HBE 280多態性條帶數都有7條。預期產物大小在100～300 bp，實測產物大部分在100～300 bp，只有引物HBE 043、HBE 090、HBE 136、HBE 280、HBE 316產物大小在300 bp以上，總體說明引物設計較為合理，具有一定的代表性。

2.1.2 AFLP分析 引物SE3-SM6對部分橡膠樹種質的AFLP指紋圖譜見圖2，25對引物組合擴增的多態性結果見表2。

對所有的橡膠樹種質材料，應用多態性強的25對引物組合[6，12]進行多態性擴增，獲得了供試材料的AFLP指紋圖譜。分析圖譜可知：引物組合多態性在39.22%～81.63%之間，多態性最好的引物組合是SE7 SM10，最差的是SE9 SM16；引物組合擴增的譜帶數在35～68之間，平均達52條，SE16 SM14 擴增譜帶數最多，達68條譜帶；SE13 SM11擴增譜帶數最少，只有35條。所有引物組合共擴增出701條多態性帶，占總擴增帶（1 274條帶）的55.02%。

2.2 SSR與AFLP標記對供試品種鑒定信息獲取量比較

利用多態性強的SSR和AFLP引物，分別對所有供試巴西橡膠樹種質材料進行擴增，擴增結果詳見表3。

從SSR引物擴增結果可知：引物HBE 084、HBE 126、HBE 192、HBE 280具有最高多態性標記數，為7個，引物HBE 014、HBE 017擴增出的多態性標記最少，只有2個；4對引物表現出特異性標記，可以鑒別其中4份材料；19對SSR引物共擴增出92個多態性標記。

從AFLP引物擴增圖譜可以看出：SE7 SM10引物組合多態性最好，擴增出40個多態性標記位點；引物組合SE3 SM9和SE13 SM11擴增的多態性標記最少，只有19個；25對引物組合都表現出特異性標記，可以鑒別其中12份材料；25對AFLP引物組合總計擴增出701個多態性標記。

對比2種標記方法的擴增結果可知，AFLP多態性標記的數量遠遠多于SSR， AFLP獲得的總標記數也遠遠多于SSR標記；就單引物而言，AFLP揭示的特異性位點明顯多于SSR標記。初步表明AFLP標記比SSR標記更適合于巴西橡膠樹種質材料間的鑒別、指紋圖譜分析等微觀系統研究。

2.3 SSR與AFLP標記對供試種質材料鑒別效率的比較

根據SSR標記對所有供試橡膠樹材料的遺傳相似系數進行UPGMA聚類分析，得到聚類樹狀圖詳見圖3。

根據AFLP標記對所有供試橡膠樹材料的EXCEL表格數據，轉換為單匹配數據矩陣，AFLP聚類分析，獲得親緣關系樹狀圖，見圖4（UPGMA法）。

2.3.1 AFLP引物組合鑒別橡膠種質材料效率分析

25對AFLP引物分別利用NTsys一pc2.lla 軟件進行單獨聚類分析，獲得25個AFLP聚類樹狀圖。通過分析所有樹狀圖可知：各引物組合鑒別的效率不同，引物組合SE7 SM10鑒別效率最強，可以鑒別其中172份材料，鑒別率達96.62%；其次為引物組合SE4 SM10，可以鑒別165份材料，鑒別率達87.77%；引物組合SE3 SM6鑒別效率最差，鑒別出87份材料，鑒別率只有46.28%。各引物組合的鑒別效率詳見表4。

從表3和表4分析可知，SSR與AFLP標記方法的鑒別效率不同。利用SSR標記方法，平均每對引物可以鑒別9.3份材料，單引物最高可以鑒別78份材料，但所有供試材料中有2份材料無法鑒別；利用AFLP標記方法，平均每個引物組合可以鑒別7.1份材料，單引物最高可以鑒別172份材料，且可以鑒別所有供試巴西橡膠樹種質材料。再結合AFLP引物組合鑒別效率分析可知，AFLP標記比SSR標記更適于巴西橡膠樹種質資源的鑒定。

3 討論

生物技術日益發達的今天，分子標記技術也在不斷地發展與豐富。每種分子標記方法，其技術原理、檢測手段都不相同，因此每種標記揭示的微觀上遺傳與變異也不相同，穩定性與重現性也各不相同，各種標記所揭示的遺傳信息量和產出效率也有很大差別。通過本試驗對比分析可以看出，在檢測巴西橡膠樹DNA多態性方面，AFLP比SSR多態性比率更大，更適合其種質資源的鑒定與保護。

SSR分子標記是基于PCR技術的新一代分子標記技術，其克服了RAPD和RFLP標記的不足。SSR多態性產生的機制不是單堿基突變或插入缺失造成的，而是因為DNA復制和修復過程中堿基的錯配、滑動和減數分裂過程中姊妹染色單體的不均等交換[19]，因而表現出高度的多態性。Pejic等[20]分析比較研究玉米自交系間的遺傳差異，得到SSR的多態性信息量是RAPD和RFLP的2倍。AFLP技術，擴增片段長度多態性[21]，是基于PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，其可通過改變限制性內切酶種類和選擇性堿基種類或數目來調節擴增的條帶數，因此具有較強的多態分辨能力，是一項新的分子標記技術。AFLP技術檢測效率高，每個AFLP 反應能檢出多態片段很多，信息量很大，并不是因為每個位點具有豐富的等位基因形式[22]，是因為其在一次單個反應中可以檢測到大量的片段。本研究SSR標記對所有供試材料進行聚類分析，但所有供試材料中有2份材料無法鑒別，可能是由于橡膠樹是異花授粉作物，長期存在自然雜交的現象，不僅在品種間存在著遺傳變異，在同一種群內也存在遺傳變異，SSR標記多態性還無法完全鑒別所有的供試材料；而AFLP標記可以鑒別所有的供試材料，可見AFLP標記在橡膠樹種質資源的研究中表現出更高的多態性。本研究SSR標記和AFLP標記，比較2種標記方法獲得的結果可知，其多態性結果與其他作物中表現的情況不盡相同，可能是研究的物種不同，表現出的結果也不盡相同，有待試驗進一步驗證。因此，從本研究比較結果可以看出，AFLP分子標記技術比SSR更適合于巴西橡膠樹種質材料的鑒定和保護。

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