海南省3種油茶炭疽病菌的致病力及其生物學特性研究

李楊 李河 周國英 蔣越西 劉君昂

摘 要 為了弄清海南省不同油茶炭疽病菌致病力差異及生物學特性，采用刺傷接種法對3種油茶炭疽病菌（C. fructicola、C. siamense、C. camelliae）的致病力進行測定，發現不同病原間致病力存在顯著差異，其中C. fructicola致病力最強，C. siamense致病力次之，C. camelliae致病力最弱。對3種炭疽病菌生物學特性研究發現，3種病菌最適生長溫度、pH值及光照條件類似，同時均可利用多種碳、氮源，但不同病菌生長的最優碳源、氮源有一定差異。C. fructicola的產孢量、分生孢子萌發率及附著胞形成率均高于C. siamense及C. camelliae。不同油茶炭疽病菌生物學特性的差異可能與其致病力分化有關。本研究結果將為進一步研究不同油茶炭疽病菌致病差異機制提供理論依據。

關鍵詞 油茶；炭疽病菌；致病力；生物學特性；分生孢子萌發；附著胞形成

中圖分類號 S794.4 文獻標識碼 A

Abstract To clarify the virulence and biological characteristics of pathogens causing Camellia oleifera anthracnose in Hainan Province， wound inoculation was used to investigate the virulence of the three pathogens （Colletotrichum fructicola， C. siamense and C. camelliae） on C. oleifera. Significant difference was found in the virulence among the three pathogens. C. fructicola showed the strongest virulence to C. oleifera followed by C. siamense and C. camelliae in sequence. Biological characteristics of the three pathogens were investigated. It was similar on optimum temperatures， pH values and lights for the growth of the pathogens. These pathogens could utilize different kinds of carbon and nitrogen sources， but the optimum carbon and nitrogen sources for the growth of the pathogens were different from each other. C. fructicola had higher performance in sporulation， conidial germination and appressorial formation， compared with C. siamense and C. camelliae. The difference in the biological characteristics of the pathogens may be associated with their differentiated virulence. The results would provide a theoretical basis for further study of the pathogenic mechanism of the pathogens causing C. oleifera anthracnose.

Key words Camellia oleifera；Anthracnose pathogen；Virulence；Biological characteristic；Conidial germination； Appressorial formation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.018

炭疽病是油茶最重要的病害之一，由炭疽屬（Colletotrichum Corda）真菌引起，導致油茶落葉、落果，造成嚴重的經濟損失。許多研究認為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是引起油茶炭疽病的病原菌[1-5]。目前研究表明，膠孢炭疽菌是由炭疽屬真菌中的許多種組成的復合種，Weir等[6]利用多基因譜系方法將膠孢炭疽菌復合種劃分成22個種和1個亞種。近幾年研究發現，引起油茶炭疽病的病原不止一種，李河等[7-8]利用ITS-CAL-GAPDH 3基因序列聯合分析，發現果生刺盤孢菌（C. fructicola）和暹邏刺盤孢菌（C. siamense）也是油茶炭疽病的致病菌。為了有效防治油茶炭疽病，國內學者在油茶炭疽病原的鑒定[9]、生物防治[10]、品種抗性[11]等方面取得了一定的研究進展，但是不同油茶炭疽病菌在致病力分化、生物學特性等方面的比較研究未見報道。研究不同病菌致病力分化及生物學特性可為有效地、針對性地防治油茶炭疽病和抗病育種提供理論依據。

油茶是海南島傳統油料樹種，在海南省內分布廣泛，且栽培面積不斷增加。海南省高溫高濕的氣候條件使得油茶炭疽病在島內普遍發生，危害日益嚴重。筆者從海南省4個油茶林中分離鑒定了3種油茶炭疽病菌，并對其致病力及生物學特性進行比較研究，目的是闡明不同油茶炭疽病菌致病力差異，同時初步研究病原菌致病力與其生物學特性之間是否相關，旨在為進一步揭示油茶炭疽病菌致病力分化機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

油茶炭疽病葉樣品采自海南省南圣鎮、通什鎮、楓木林場及澄邁林場4個樣地，病原菌通過組織分離法，并經柯赫氏法則驗證以及綜合病菌形態、多基因序列分析鑒定為炭疽病菌[12]，菌株分離地、數量等信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 致病力測定 每個采樣地每種油茶炭疽病菌隨機選取1株菌株，采用離體葉片接種進行致病力測定。方法如下：無菌水配制3種油茶炭疽病菌分生孢子懸浮液（1×105個/mL）。選取健康、大小一致的2年生“湘林1號”油茶葉片作為接種對象，用75%酒精將葉片消毒30 s，再用無菌水將葉片清洗3次后晾干，使用一次性注射器針頭將葉片背面表皮挑破但不刺穿，移液器滴加20 μL孢子懸浮液于傷口處，以滴加等量無菌水作為對照。每菌株接種10張葉片，實驗重復3次，葉片放置鋪有濕潤脫脂棉的培養皿中，置于28 ℃恒溫箱中培養。葉片產生癥狀后，對油茶葉片進行病情分級。

病害分級標準如下：0級為不發病；1級（0<病斑直徑≤2 mm）； 2級（2 mm<病斑直徑≤5 mm）； 3級（5 mm<病斑直徑≤10 mm）； 4級（10 mm<病斑直徑≤15 mm）； 5級（病斑直徑>15 mm）。

1.2.2 溫度、pH值及光照對菌株菌絲生長影響

將培養7 d的3種炭疽病菌菌塊（d=5 mm）分別接至新的PDA培養基中，設計以下條件進行培養：（1）放至10、15、20、25、28、30、35及40 ℃恒溫培養箱中黑暗培養，每處理3個重復； （2）配制pH值分別為4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培養基，將3種炭疽病菌菌塊分別接至上述平板中，每處理3個重復； （3）將接種后的平板放置于完全光照、12 h光照/12 h黑暗、完全黑暗下進行培養，每處理3個重復。5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3 不同碳源、氮源對菌株菌絲生長影響 以察式培養基為基礎[13]，分別以葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、果糖作為培養基中的碳源，以牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、酵母浸粉作為培養基中的氮源，將3種炭疽病菌菌塊（d=5 mm）分別接至含有不同碳源、不同氮源的平板中，以不添加碳、氮源培養基為對照，28 ℃恒溫培養，每處理3個重復，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 不同油茶炭疽病菌產孢能力、孢子萌發率及附著胞形成率比較 產孢能力：將培養7 d的3種炭疽病原菌塊（d=5 mm）分別接至100 mLPDA液體培養基中，160 r/min，28 ℃恒溫震蕩培養，第5天用孢子過濾器收集孢子，并配制成懸浮液，利用血球計數板計算分生孢子數；孢子萌發率及附著胞形成率：將濃度為1×105個/mL的孢子懸浮液加入凹玻片中，將凹玻片移入放有濕潤脫脂棉的培養皿中，培養皿置于28 ℃培養箱中培養，每處理為5張玻片，每片檢查80個孢子，重復3次，12、24 h觀察并記錄分生孢子萌發率（以芽管長度超過孢子長度1/2為萌發），觀察并統計孢子萌發率及附著胞形成率。

1.3 數據分析

利用SPSS、Excel軟件對數據進行統計與分析，用最小顯著差數法（LSD）比較相同條件下3種油茶炭疽病菌的差異顯著性（p=0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同油茶炭疽病菌致病力比較

從海南省分離到的油茶炭疽病菌對油茶葉片的致病性測定結果發現，所有供試菌株均能引起油茶葉片發病（圖1），對照組中葉片刺傷處有很小的黑點，但并未擴展。由表2可知，從4個油茶林中分離到的3種炭疽病菌的致病力存在較大差異，但屬于同種病菌的不同菌株間致病力差異不大，其中C. fructicola致病力最強，病情指數為76.33～78.33，明顯高于其他油茶炭疽病菌；而C. siamense致病力較強，病情指數為61.67～65.83。從澄邁林場分離的C. camelliae致病力低于C. fructicola及C. siamense，病情指數僅為57.5。從總體來看，3種病菌的致病力依次為C. fructicola>C. siamense>C. camelliae，與3種病菌的分離率相一致。

2.2 病原菌生物學特性

2.2.1 溫度、pH值及光照對不同炭疽菌生長的影響 由圖2可知，3種油茶炭疽病菌在10～35 ℃范圍內生長，且生長趨勢類似，最適生長溫度均為28 ℃；在同一溫度下，C. siamense、C. fructicola與C. camelliae菌落生長均存在顯著差異；28 ℃時，C. siamense生長最快，其次是C. fructicola，C. camelliae生長較慢。由圖3可知，3種病菌在pH4.0～11.0范圍內均可生長，當pH6.0時，3種病菌均生長最快，且菌落直徑有一定差異，C. fructicola為62.3 mm、C. siamense為64.7 mm、C. camelliae為57.4 mm。除pH5和pH6，C. fructicola與C. siamense菌落大小差異不顯著，但兩者與C. camelliae存在顯著差異。由表3可知，在相同光照處理下，C. fructicola、C. siamense與C. camelliae的菌落大小存在顯著差異；在12 h光照/12 h黑暗處理下，C. fructicola與C. siamense菌落直徑均達到最大值，但C. camelliae在連續光照條件下生長最快，這可能與菌株本身特點有關。

2.2.2 不同碳源、氮源對炭疽病菌生長的影響 由圖4可知，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae均可在不同碳源上生長，除了以果糖為碳源外，3種病菌在相同碳源上生長均存在顯著差異，其中C. fructicola和C. siamense在碳源為葡萄糖、麥芽糖的培養基中生長最好；C. camelliae在乳糖、葡萄糖中生長最好，且3種病菌在淀粉培養基中生長差。當碳源為葡萄糖時，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae的菌落直徑分別為62.1、62.5和55.7 mm；當碳源為麥芽糖時，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae的菌落直徑分別為60.5、61.0和55.0 mm。

由圖5可知，3種病菌對不同氮源的利用存在較大差異。C. fructicola在牛肉膏及酵母浸粉培養基上菌落直徑最大，C. siamense在硝酸鉀培養基中菌落直徑最大，C. camelliae在蛋白質培養基上生長最好；3種病菌在氮源為氯化銨、硫酸銨的培養基上生長無顯著差異，均生長最差，菌落直徑為20 mm左右，可見氯化銨、硫酸銨對炭疽病菌菌絲的生長有抑制作用。

2.2.3 不同油茶炭疽病原產孢能力、孢子萌發率及附著胞形成率比較 3種油茶炭疽病原菌的產孢能力有差異，在培養5 d后，C. fructicola、C. siamense和C. camelliae產孢量分別達到35.1×106、29.6×106和25.5×106個/mL。培養4 h后，C. fructicola和C. siamense的分生孢子開始萌發，6 h后C. camelliae的分生孢子開始萌發（圖6）。培養12和24 h后，3種病菌在分生孢子萌發率及附著胞形成率上均存在顯著差異，C. fructicola的分生孢子萌發率及附著胞形成率高于其他病菌（圖7），而C. camelliae分生孢子萌發率及附著胞形成率最低。

3 討論與結論

一種炭疽病菌可侵染多種寄主植物，同時多種炭疽病菌也可以侵染同一寄主植物。例如引起辣椒炭疽病的有C. acutatum、C. truncatum、C. fructicola和C. siamense等4種致病菌[14-16]。本實驗室研究成員前期從海南省4個油茶林中分離鑒定了34株油茶炭疽病菌，共有3種不同炭疽病菌：C. fructicola、C. siamense及C. camelliae。本研究采用刺傷接種法對3種油茶炭疽病菌的致病力進行測定，發現3種病菌存在明顯的致病力分化，并且致病力最強的C. fructicola在所有菌株中所占比例最大。王曉艷[17]從東北三省大豆主產區分離到8種鐮刀菌，通過致病力測定，發現在黑龍江、吉林和遼寧省F. oxysporum的致病力都是最強，病情指數明顯高于其他Fusarium spp.，同時F. oxysporum在分離到的8種鐮刀菌中出現頻率最高。本研究推測菌株致病力越強可能對環境的適應能力越強，因此在自然界中容易擴展其分布范圍，這有待于進一步研究。

3種油茶炭疽病菌生物學特性觀察結果表明，在相同溫度、pH、光照條件、碳源和氮源的條件下，3種油茶炭疽病菌的菌絲生長存在一定差異。3種油茶炭疽病菌均可在10～35 ℃范圍內生長，且最適生長溫度均為28 ℃，這與朱英芝[9]的研究結果一致；3種病菌均可在pH4.0～11.0范圍內生長，且在pH6.0時菌絲生長最快，這與史紅安[18]報道的結果類似。強致病力C. fructicola的產孢能力、孢子萌發率及附著胞形成率均高于C. siamense和C. camelliae，推測不同油茶炭疽病菌的致病力可能與其產孢量、孢子萌發率及附著胞形成率存在一定關系。張新春等[19]對11株不同來源的荔枝膠孢炭疽菌進行了致病性測定，發現不同菌株的致病性存在差異，并發現強致病力菌株和弱致病力菌株在分生孢子及分生孢子盤形態方面存在一定差異，而在菌絲生長、形態等方面類似；朱荷琴等[20]對棉花黃萎病不同致病菌株的生物學特性進行了比較，發現強致病菌株的生長量、產孢量及產毒量都高于弱致病菌株。

附著胞是病原菌在其芽管或老菌絲頂端發生膨大，分泌黏狀物，借以牢固地粘在宿主表面的一種侵染結構，在其下形成纖細的針狀感染菌絲，以侵入宿主的角質表皮而吸取養料[21]。因此，病菌附著胞形成的多少及快慢可能與其致病力有一定關系，致病力較強的菌株更易侵染油茶，使其在自然界生態位競爭與繁殖中占有優勢。但致病力差異不僅僅是菌株產孢量、分生孢子萌發率及附著胞形成率的差別，還與菌株其他遺傳特性有很大關系，筆者僅就3種油茶炭疽病菌的部分生物學特性進行了探討，接下來可對不同油茶炭疽病菌的致病差異機制進行研究，為針對性地防治油菜炭疽病提供理論依據。

參考文獻

[1] 周仲銘. 林木病理學[M]. 北京： 中國林業出版社， 1990： 117-119.

[2] 袁嗣令， 邵力平， 李傳道. 中國喬、 灌木病害[M]. 北京： 科學出版社， 1997： 42.

[3] 楊光道， 束慶龍， 段 琳，等. 主要油茶品種對炭疽病的抗性研究[J]. 安徽農業大學學報， 2004， 31（4）： 480-483.

[4] 劉 偉. 油茶炭疽病的病原學、發生規律及防治技術研究[D]. 武漢： 華中農業大學， 2012.

[5] 崔之益， 李蕊萍， 胡加新， 等. 油茶炭疽病研究進展[J]. 現代農業科技， 2014（12）： 141-142.

[6] Weir B S， Johnston P R， Damm U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in Mycology， 2012， 73（1）： 115-180.

[7] 李 河， 周國英， 徐建平，等. 一種油茶新炭疽病原的多基因系統發育分析鑒定[J]. 植物保護學報， 2014， 41（5）： 602-607.

[8] 李 河， 周國英，徐建平. 一種新油茶炭疽病原多基因序列鑒定[J]. 植物保護， 2015， 41（2）： 92-96.

[9] 朱英芝， 廖旺姣， 鄒東霞，等. 廣西油茶炭疽病病原菌鑒定及生物學特性[J]. 植物保護學報， 2015， 42（3）： 382-389.

[10] 游 嘉， 周國英， 劉君昂，等. 油茶內生拮抗細菌Y13菌劑研制[J]. 中南林業科技大學學報， 2010， 30（4）： 131-134.

[11] 楊 華， 趙丹陽， 秦長生，等. 不同油茶種和品種對炭疽病的抗性觀察[J]. 植物保護， 2015， 41（2）： 195-199.

[12] 李 河， 李 楊， 蔣仕強，等. 海南省不同寄主植物炭疽病菌侵染油茶研究[J]. 植物保護， 2016， 42（4）： 64-70.

[13] 方中達. 植物病理研究方法（第3版）[M]. 北京：中國農業出版社， 1998： 50.

[14] Diao Y， Zhang C， Xu J， et al. Genetic differentiation and recombination among geographic populations of the fungalpathogen Colletotrichum truncatum from chili peppers in China[J]. Evolutionary Applications， 2015， 8（1）： 108-118.

[15] Sharma G， Shenoy B D. Colletotrichum fructicola and C. siamense are involved in chilli anthracnose in India[J]. Archives of Phytopathology and Plant Protection， 2014， 47（10）： 1 179-1 194.

[16] Vitale S， Infantino A. Presence of Colletotrichum acutatum causing anthracnose on hot pepper in central Italy[J]. Journal of Plant Pathology， 2014， 96（3）： 607.

[17] 王曉艷，文景芝. 東北三省大豆根腐鐮孢菌種類及其致病力分析[J]. 中國油料作物學報， 2011， 33（4）： 391-395.

[18] 史紅安， 傅本重， 張志林，等. 侵染油茶的兩種病原菌的鑒定及其生物學特性研究[J]. 湖北農業科學， 2015， 54（23）： 5 908-5 911.

[19] 張新春， 彭元科，王家保. 不同來源荔枝膠孢炭疽菌生物學特性研究[J]. 中國果樹， 2015（3）： 27-31.

[20] 朱荷琴， 宋曉軒，簡桂良. 棉花黃萎病菌致病力變異生理機制的初步研究[J]. 棉花學報， 2004， 16（5）： 275-279.

[21] 張敬澤， 胡東維. 影響柿樹炭疽菌孢子萌發、附著胞形成及致病性的環境因子[J]. 植物病理學報， 2004， 34（2）： 154-161.