黑麥草EST—SSR分子標記開發及生物信息學分析

王秀華 李家麗 蒲艷艷 叢曉翔 林雪婷 于鴻翔 趙巖

摘要：為加速分子標記在黑麥草中的應用，利用黑麥草EST數據庫（GenBank/dbEST）開展了黑麥草EST-SSR信息分析、標記開發和EST功能分析研究。在25 752條黑麥草EST序列中，共發現346條SSR序列，占整個EST總數的1.344%。其中，三核苷酸基序最多（39.60%），次之為二核苷酸基序（31.79%）。三核苷酸基序以GGC/CCG出現頻率最高，為8.38%，其次是CGC/GCG（7.51%）、GCC/CGG（4.05%）和ATG/TAC（2.02%），二核苷酸基序以CT/GA出現頻率最高（14.45%），其次是GA/CT（10.98%）。根據這些含有SSR的EST序列，利用Primer Premier 5.0軟件，對346條EST-SSR序列進行引物設計，共設計引物193對，其中分值在90分以上的有113對（32.66%）。利用GenBank的BlastN和BlastX程序對相應113條EST進行功能分析，72條EST序列與51種具有生物學功能的蛋白質同源。

關鍵詞：黑麥草；EST-SSR；信息分析；引物設計；功能分析

中圖分類號：S543+.601文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）10-0001-06

黑麥草屬禾本科（Poaceae）黑麥草屬（Lolium）植物。其中最具有商業價值的兩個種為多年生黑麥草（Lolium perenne L.）和多花黑麥草（Lolium multiflroum L.），作為草坪草和優質牧草在我國均有大面積栽培和利用[1，2]。

目前，黑麥草中常用的分子標記技術主要有RAPD[3]、CAPS[4]、AFLP[4，5]、SSR[6]、EST-SSR[7]等。SSR（simple sequence repeat）標記在遺傳圖譜的構建[8]、遺傳多樣性和親緣關系分析[9]、品種指紋圖譜及純度鑒定[10]、功能基因標記[11]等方面具有公認的優越性和廣闊的應用前景。但傳統的基因組SSR標記開發投入多、耗時長。近年來，隨著GenBank中大量EST（expressed sequence tags）序列的公布，許多植物基于EST的SSR（EST-SSR）標記開發成為可能。與基因組SSR相比，EST-SSR具有開發成本低、物種間通用性高、可直接反映相關基因的多樣性等突出優點。目前許多作物如小麥、大麥、高羊茅、蒺藜苜蓿等的EST-SSR已被開發并用于遺傳作圖、遺傳多樣性、基因發掘、比較作圖等研究[12-15]。

本研究利用NCBI上的黑麥草EST序列查找SSR，對其進行信息分析，設計EST-SSR引物，開發黑麥草EST-SSR分子標記，并對相應EST進行功能分析。

1材料與方法

1.1EST序列來源

從http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/下載黑麥草EST序列。

1.2EST-SSR的查找

登陸網站http：//archive.gramene.org/db/markers/ssrtool，利用SSRIT（simple sequence repeat identification tool）軟件在線查找二、三、四、五、六核苷酸5種類型的SSR。識別標準為：重復基序最小長度≥18 bp，即二、三、四、五、六核苷酸重復次數分別大于或等于10、7、5、4、3。

1.3EST-SSR引物設計

利用Primer Premier 5.0軟件，根據SSR的側翼區域設計引物。引物設計的主要參數：EST序列長度大于100 bp；SSR序列的開始和結束位置分別距5′和3′端不少于20 bp；引物長度18～22 bp；退火溫度Tm值 50～65℃，而且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃；PCR擴增產物長度100～300 bp；得分90分以上，盡量避免引物二級結構的出現。

1.4EST功能分析

利用NCBI網站對篩選出的黑麥草EST序列進行Blast比對，包括BlastN和BlastX兩種比對，得到與其他植物已知基因或蛋白相似的功能，獲得該EST在草坪草中的預測功能。利用BlastN程序在核苷酸水平上進行同源性分析，認為序列比分值大于200，e-value ≤1×10-20的序列具有同源核苷酸片段，而比對的片段長度小于50 bp結果不予采納；對符合上述要求的EST序列利用BlastX程序在翻譯水平上對其進行分析，序列比分值大于80的結果認為有相似性顯著的同源蛋白質。

2結果與分析

2.1源于黑麥草EST的SSR查找

從NCBI上共下載到黑麥草的25 752條EST序列（其中多年生黑麥草19 784條，多花黑麥草5 968條）。經SSR查找，共發現346條SSR序列，占整個EST數據庫的1.344%；這些EST序列全長17 720 kb，平均每1 000 kb 出現19.53個SSR，即每51.21 kb出現1個SSR。含有二、三、四和五核苷酸重復基序分別占SSR總數的31.79%、39.60%、11.27%和17.34%，無六核苷酸重復基序，三核苷酸基序出現頻率最高，次之為二核苷酸基序（表1）。

2.2黑麥草EST-SSR的特征分析

346個SSR中，二核苷酸基序以CT/GA出現頻率最高，占SSR總數的14.45%，其次是GA/CT（10.98%）和AT/TA（1.73%）。三核苷酸基序以GGC/CCG出現的頻率最高，為8.38%，其次是CGC/GCG（7.51%）、GCC/CGG（4.05%）和ATG/TAC（2.02%），其他類型出現頻率較低。四核苷酸基序以GTTG/CAAC出現頻率最高，為0.87%。五核苷酸以TGTCG/ACAGC（2.31%）和CTCAT/GAGTA（2.02%）出現頻率較高，其余出現頻率均較低（表2）。

2.3黑麥草EST-SSR引物的開發

利用Primer Premier 5.0軟件，對346個EST-SSR序列進行引物設計，共設計引物193對（55.78%），分值在90分以上的有113對（32.66%），見表3。

2.4功能分析

利用NCBI的BlastN和BlastX程序，對113條EST-SSR引物相應的EST序列進行比對分析。有78條EST序列與具有生物功能的核酸有同源性（未列出），有72條EST序列與具有生物功能的蛋白質有同源性（表4）。這72條蛋白序列分屬于51種蛋白，大部分的同源產物來源于二穗短柄草（31.94%）或烏拉爾圖小麥（15.28%）。

3討論

目前，水稻[16]、小麥[17-19]、玉米[20]等主要糧食作物的EST-SSR標記已得到大量開發和應用。草類植物EST-SSR標記的開發和應用還較少。隨著草坪草、牧草等草類植物EST和cDNA大規模測序的開展，相應EST數目也在急劇增加，其EST-SSR引物的開發與利用展現了廣闊的前景[14，21-24]。截至2015年11月14日，在GenBank數據庫（http：//www.ncbi. nlm.nih. gov/dbEST）中找到的黑麥草的EST序列已達到25 752條。我們利用這25 752條EST序列，對346個EST-SSR序列進行引物設計，設計了113個分值90以上的引物對，為黑麥草增加了新的分子標記。

前人對EST-SSR的出現頻率及重復基元出現頻率進行了大量研究。關于EST中SSR出現頻率，Chen等[17]對小麥EST-SSR進行開發時，每57.44 kb出現一個SSR；而李杰勤等[21]在高粱中研究結果為平均3.93 kb。這可能是由所研究的EST數據庫不同及不同的EST-SSR搜索標準和統計標準所致。本研究在25 752條黑麥草EST序列中，共找到346條SSR序列，占整個EST數據庫的1.344%，平均分布距離為51.21 kb。本研究結果和Chen等[17]研究結論相近。關于EST中不同核苷酸數目的重復基元出現頻率，本研究中三核苷酸基序出現頻率最高（39.60%），次之為二核苷酸基序（31.79%）。三核苷酸基序以GGC/CCG出現的頻率最高，為8.38%，其次是CGC/GCG（7.51%），二核苷酸基序以CT/GA出現頻率最高，占SSR總數的14.45%，其次是GA/CT（10.98%）。前人多數研究結果也為三核苷酸重復基元出現頻率最高[25，26]。在水稻、玉米、大豆、高粱中二核苷酸重復基序出現頻率最多的都是GA/CT[19]，在水稻、玉米、大麥中，三核苷酸的CCG/GGC和AGG/TCC出現頻率高[19，26，27]。本研究結果與在大多數植物基因組中三核苷酸重復出現頻率較高的結果是一致的，二、三核苷酸不同基序出現頻率也與多數結果一致。

利用生物信息學對EST序列進行功能分析，可推測該EST序列的功能，使隨機測序而獲得的EST序列與特定的生物功能相聯系，有助于EST-SSR的進一步利用。而那些通過比對不能發現同源核苷酸或蛋白質的EST序列，可能是新的功能基因，EST-SSR引物就可作為這些新基因的分子標記，為基因克隆與功能驗證奠定標記基礎。高瑞娟等[28]在比對結球白菜EST時，94.8%（1102/1162）的EST可在蛋白質或核苷酸水平上找到同源類似物，大約77%的功能已知蛋白質來自擬南芥。本文利用NCBI的BlastN和BlastX程序對113條EST-SSR引物對應的EST序列進行了比對分析。結果表明，72條EST序列有生物學意義上的同源序列（63.72%），與高瑞娟等研究結果類似。我們比對的大部分的同源產物來源于二穗短柄草（31.94%）或烏拉爾圖小麥（15.28%），得益于這兩個物種特別是草類模式植物二穗短柄草近年來基因組研究的飛速發展。

4結論

在GenBank/dbEST中檢索到黑麥草的EST序列25 752條，其中346個EST序列含有SSR（1.344%），共設計了分值90以上的EST-SSR引物113對。EST-SSR信息分析表明，三核苷酸基序最多，并以GGC/CCG出現的頻率最高；次之為二核苷酸基序，并以CT/GA出現頻率最高。對113條EST-SSR引物相應的EST序列進行Blast比對分析表明，有72條EST序列與具有生物功能的蛋白質有同源性，且分為51種蛋白質，大部分的同源產物來源于二穗短柄草（31.94%）或烏拉爾圖小麥（15.28%）。

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