火龍果炭疽病病原菌的鑒定及生物學特性研究

朱迎迎 李敏 高兆銀 章武 楊冬平 陳亮

摘要：【目的】明確火龍果果實炭疽病病原菌的種類及其生物學特性，為火龍果炭疽病病害防控提供理論依據。【方法】通過致病性測定、形態學特征觀察及rDNA-ITS序列和系統發育樹分析的方法對引起火龍果果實炭疽病的病原菌進行鑒定，并初步研究其生物學特性?！窘Y果】供試菌株ITS序列為576 bp，與平頭炭疽菌（登錄號：HQ896482、AF451899）、辣椒炭疽菌（登錄號：JX910365、HQ271465）的同源性均達100%；系統發育分析結果表明，該菌株與平頭炭疽菌和辣椒炭疽菌具有很近的遺傳關系。該菌菌絲生長的適宜溫度為20～30 ℃，產孢適宜溫度為25～35 ℃，最適生長和產孢溫度為30 ℃，致死溫度為60 ℃處理10 min；菌絲適宜生長pH為4～9，最適pH為8，產孢適宜pH為4～7，最適產孢pH為4；最適碳源為蔗糖和D-果糖，最適氮源為牛肉膏和蛋白胨，可溶性淀粉和硝酸銨有利于該菌產孢；連續光照和光暗交替有利于菌絲生長，黑暗則有利于該菌產孢。【結論】引起海南省火龍果果實炭疽病的另一種病原菌是平頭炭疽菌[C. truncatum （Schw.） Andrus & Moore]，該菌不僅侵染火龍果果實，還能侵染大豆豆莢和番茄果實。

關鍵詞： 火龍果；炭疽??；平頭炭疽菌；rDNA-ITS；生物學特性

中圖分類號： S436.67 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）01-0059-08

0 引言

【研究意義】火龍果（Hylocereus undulatus）又稱紅龍果，為仙人掌科量天尺屬植物，是典型的熱帶水果（鄭良永，2004）。火龍果果實外形獨特，含豐富的植物性蛋白、礦物質、抗氧化物質等，口味佳，深受人們喜愛。近年來，隨著火龍果栽培面積的不斷擴大，其病害問題更加明顯，嚴重影響了火龍果的產量和品質（胡美姣等，2010；李敏等，2012a）。炭疽病是火龍果上的一種重要病害，具有潛伏侵染性，主要危害火龍果果實，常在采后貯運時發生，造成重大經濟損失（袁誠林等，2004；李茂和蔣昌順，2008；Phoulivong et al.，2010）。因此，對火龍果果實炭疽病病原菌進行分離、鑒定，并初步探究其生物學特性，對火龍果炭疽病的綜合防治具有重要意義。【前人研究進展】關于火龍果病害，前人的研究主要集中在采前田間病害防治方面，在果實采后病害方面的研究報道較少。胡美姣等（2010）對火龍果采后病害研究發現，膠孢炭疽菌（Collectotrichum gloeosporioides）是引起火龍果果實炭疽病的主要病原菌。李敏等（2012b）對火龍果采后病害發生種類及病原菌種類進行調查，發現膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）和辣椒炭疽菌（C. capsici）是引起海南省火龍果果實炭疽病的兩種病原菌，且不同的病原菌所引起的病害癥狀不同。鄭偉等（2014）對從火龍果炭疽病病株上分離得到的病原菌進行形態特征、致病性及核糖體DNA-ITS序列分析，結果發現膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）和平頭炭疽菌（C. truncatum）均能引起貴州火龍果果實炭疽病，但未對病原菌的生物學特性進行研究。Guo等（2014）對火龍果果實病害進行分析，初步鑒定認為平頭炭疽菌（C. truncatum）能引起云南省火龍果果實炭疽病，并認為該病原菌最適生長溫度為25 ℃。【本研究切入點】大多數的研究認為膠孢炭疽菌是引起火龍果炭疽病的主要病原菌，而對其他病原菌引起的火龍果炭疽病及其生物學特性研究的報道較少?！緮M解決的關鍵問題】通過對海南省火龍果果實炭疽病病原菌進行分離，發現除膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）外，還有其他種類炭疽菌（Collectotrichum sp.）也能引起炭疽病，因此，本研究在前人研究的基礎上，采用組織分離、形態學特征結合分子鑒定的方法對所分離的病原菌進行種類鑒定，并初步研究其生物學特性，以期為火龍果炭疽病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

從海南省海口市各超市、水果市場采集發病火龍果果實；健康火龍果果實購于?？谑心媳彼袌?。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株分離及純化 對典型炭疽病癥狀進行描述，并采用組織分離法對病原菌進行分離純化。將所獲得菌株進行初步篩選，剔除膠孢炭疽菌，其余菌株于4 ℃保存待用。

1. 2. 2 菌株致病性測定

1. 2. 2. 1 對火龍果的致病性測定 采用損傷接種法。取28 ℃恒溫培養5 d的菌餅（ф=5 mm，下同）接種于健康火龍果果實上，每個果實接種2點，每處理3個果實，以無菌PDA培養基塊為對照，置于保鮮盒中28 ℃恒溫保濕培養，每天觀察發病情況，明確該病原菌對火龍果的致病性。

1. 2. 2. 2 對其他作物的致病性測定 采用損傷接種法。取28 ℃恒溫培養5 d的菌餅接種于健康大豆豆莢和番茄果實上，置于保鮮盒中28 ℃恒溫保濕培養，每天觀察發病情況，明確該病原菌對大豆豆莢和番茄的致病性。

1. 2. 3 病原菌形態學觀察及鑒定 將純化后的菌株接種于PDA培養基上，28 ℃倒置培養，每天觀察菌落特征，在顯微鏡下觀察菌絲體形態、產孢結構、剛毛及孢子形態、顏色、大小等特征，同時參考已有文獻（戚佩坤，2000；陸家云，2001）進行病原菌形態學鑒定。

1. 2. 4 病原菌rDNA-ITS區擴增和序列分析

1. 2. 4. 1 病原菌基因組DNA提取及rDNA-ITS區PCR擴增 用滅菌小藥勺輕輕刮取約100 mg新鮮菌絲于研缽中，用液氮充分研磨成粉狀，采用植物基因組DNA提取試劑盒[購于天根生化科技（北京）有限公司]對病原菌基因組DNA進行提取。參照White等（1990）設計的真菌rDNA-ITS通用引物（上游引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對病原菌rDNA-ITS區進行PCR擴增。PCR反應體系（50.0 μL）：1.0 μL病原菌DNA，2.0 μL 10 μmol/L ITS1，2.0 μL 10 μmol/L ITS4，25.0 μL 2×（HS）Taq-Mixture，20.0 μL ddH2O。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。

1. 2. 4. 2 病原菌rDNA-ITS序列克隆及測序 采用TA Cloning試劑盒（購于Invitrogen公司）將回收純化產物連接轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞。將PCR檢測陽性的產物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司測序，將測序結果在NCBI網站上用BLAST軟件與已知的植物病原菌ITS基因進行比對，分析它們之間的生物相似性。

1. 2. 5 病原菌生物學特性研究

1. 2. 5. 1 不同溫度對菌絲生長和產孢量的影響 挑取菌齡一致的菌餅于PDA培養基上，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35和40 ℃下倒置培養，每處理3個皿，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，10 d后用10 mL無菌水洗下孢子，采用血細胞計數板測定各梯度產孢量。重復3次。

1. 2. 5. 2 不同pH對菌絲生長和產孢量的影響 用無菌的0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調節滅菌后PDA培養基，制成pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10和11的9種培養基，將菌餅分別接種于不同pH PDA培養基上，28 ℃倒置培養，其余方法同1.2.5.1。

1. 2. 5. 3 不同光照對菌絲生長和產孢量的影響 將菌餅接種于PDA培養基上，分別在黑暗、12 h光暗交替和連續光照的條件下，28 ℃倒置培養，其余方法同1.2.5.1。

1. 2. 5. 4 不同碳源對菌絲生長和產孢量的影響 參考胡美姣等（2013）的方法并略加修改。以査氏培養基為基礎培養基（沈萍和陳向東，2007），分別用等摩爾C量的D-果糖、山梨醇、D-半乳糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、D-木糖代替蔗糖，以無碳源培養基作對照，其余方法同1.2.5.1。

1. 2. 5. 5 不同氮源對菌絲生長和產孢量的影響 參考胡美姣等（2013）方法并略加修改。以査氏培養基為基礎培養基（沈萍和陳向東，2007），分別用等摩爾N量的牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、硝酸銨、硝酸鈉、尿素代替硝酸鈉，以無氮源培養基作對照，其余方法同1.2.5.1。

1. 2. 5. 6 致死溫度測定 取菌餅置于含5 mL無菌水的離心管中，分別于50、55、60、65、70和75 ℃恒溫水浴10 min，挑取菌餅接種至PDA培養基上，倒置培養，每天觀察菌落生長情況。每處理3皿，重復4次。

1. 3 統計分析

利用SAS 8.1軟件對試驗數據進行處理，采用Duncans法進行多重比較分析。

2 結果與分析

2. 1 病害癥狀

該病危害火龍果果實，引起果實大量腐爛。發病初期，在果皮及其鱗片上出現污黃色、水漬狀的小斑點，圓形，病斑擴大后，邊緣呈污黃色至黃褐色水漬狀、中央黑色凹陷，其上布滿許多小顆粒，即為分生孢子盤及分生孢子（圖1）。濕潤時，發病部位長出紅色粘稠物質，即為分生孢子堆。

2. 2 致病性測定結果

該菌可使火龍果果實致病，發病癥狀與自然發病時相似，病斑污黃色且呈較規則圓形，隨后病斑不斷擴大，中間為淡灰色至黑色，分布有黑色小點，即為分生孢子盤及分生孢子（圖2），病健交界更明顯。挑取病部病原物置于顯微鏡下觀察，可見彎曲、單胞的分生孢子。該菌也侵染大豆豆莢、番茄果實，引起嚴重腐爛（圖3）。

2. 3 病原菌形態鑒定

在PDA培養基上，該菌菌落圓形，邊緣整齊，初期灰白色，絨毛狀，后期為深灰色至墨綠色，菌絲暗灰色，菌落輪紋較清晰，基質黑褐色，菌落表面分散許多小顆粒即分生孢子盤及分生孢子，培養后期出現橘紅色孢子堆。菌核不規則，表面為黑色，內部淺褐色，組織緊密；分生孢子盤橢圓形或扁圓形，黑褐色；剛毛黑褐色，頂端色淺，較尖，具有1～3分隔，基部無明顯膨大，大小42.25～209.44 μm。分生孢子梗棒狀。分生孢子無色，鐮刀形，兩頭鈍尖，單胞，有油滴，大小17.14～26.91（21.41）μm×2.43～5.49（3.44）μm。附著胞褐色，近圓形、扁球形、棒形或不規則，大小為6.9～11.3（8.4）μm×4.5～6.4（5.4）μm。

2. 4 病原菌rDNA-ITS序列和系統發育樹分析

測序結果表明，供試菌株ITS序列為576 bp（圖5）。在NCBI上BLAST比對發現，該菌ITS序列與平頭炭疽菌（登錄號：HQ896482、AF451899）、辣椒炭疽菌（登錄號：JX910365、HQ271465）的同源性均達100%。用Neighbor-Joining構建系統發育樹，另外選取10個同源性高低不同的菌株進行多重序列比較，并進行系統發育分析。該菌與平頭炭疽菌（登錄號：HQ896482、AF451899）和辣椒炭疽菌（登錄號：JX910365、HQ27 1465）具有很近的遺傳關系（圖6）。因此，通過病原菌的形態鑒定、rDNA-ITS序列分析和系統發育樹，以及致病性測定結果，確定引起海南省火龍果果實炭疽病的另一種病原菌為平頭炭疽菌[C. truncatum（Schw.）Andrus & Moore]，該病原菌在基因庫中的登錄號為：KP731886。

2. 5 病原菌生物學特性分析

2. 5. 1 溫度對菌絲生長及產孢量的影響 由圖7可知，在5～30 ℃內，該菌菌絲生長速率隨著溫度升高而增大，在30 ℃時菌絲生長最快，菌落直徑達41.78 mm，極顯著高于其他溫度條件下的菌落直徑（P<0.01，下同）；在35 ℃時，菌絲生長速率下降，40 ℃時不生長；該菌產孢量在15～30 ℃時逐漸升高，30 ℃時的產孢量最大，為15.67×105個/mL，除與35 ℃時產孢量不顯著外（P>0.05，下同），極顯著高于其他溫度條件下的產孢量。本研究還發現，在5和40 ℃下該菌菌絲不能生長，但當溫度恢復到30 ℃時，5 ℃的菌絲呈現緩慢生長現象，而40 ℃菌絲停止生長；10 ℃時，菌絲雖然生長但不產孢。故該菌適宜生長溫度為20～30 ℃，產孢適宜溫度為25～35 ℃，最適生長和產孢溫度均為30 ℃。

2. 5. 2 pH對菌絲生長及產孢量的影響 由圖8可知，該菌在弱酸、弱堿條件下均能夠生長，在pH為3～8時，菌絲生長速率逐漸增快，pH為8時菌落最大，直徑達35.63 mm，極顯著高于其他處理的菌落大小，之后隨著pH升高，菌絲生長速率下降。該菌在pH為3時不產孢，當pH為4時產孢量最大，達9.43×105個/mL，極顯著高于其他處理的產孢量，之后隨著pH升高，產孢量下降。故該菌適宜生長pH為4～9，最適pH為8，適宜產孢pH為4～7，最適產孢pH為4。

2. 5. 3 光照對菌絲生長及產孢量的影響 由圖9可知，該菌在不同光照條件下均能生長，其中連續光照和12 h光暗交替條件下的菌落直徑極顯著高于完全黑暗條件下的菌落直徑，且前兩者菌落直徑差異不顯著。完全黑暗有利于產孢，產孢量為2.05×105個/mL，極顯著高于其他2個處理的產孢量。

2. 5. 4 不同碳源對菌絲生長及產孢量的影響 由圖10可知，該菌對蔗糖和D-果糖2種碳源的利用率最高，培養5 d后菌落直徑分別達38.07和35.79 mm，極顯著高于其他處理的菌落大小；在無碳源的培養基上菌絲雖然生長較快，但菌絲稀疏，較難觀察；對其他碳源利用高低依次為葡萄糖>D-木糖>可溶性淀粉>D-山梨醇>麥芽糖>D-半乳糖。可溶性淀粉有利于該菌產孢，產孢量最大，為12.50×105個/mL，極顯著高于其他處理的產孢量，而葡萄糖和D-木糖不利于該菌產孢。

2. 5. 5 不同氮源對菌絲生長及產孢量的影響 由圖11可知，牛肉膏和蛋白胨為該菌適宜氮源，培養5 d后菌落直徑達37.33和36.04 mm，極顯著高于其他氮源處理的菌落大??；在無氮源的培養上菌絲雖然生長較快，但菌絲稀薄；對其他氮源利用高低依次是硝酸鈉>甘氨酸>L-精氨酸>尿素>L-苯丙氨酸>硝酸銨。硝酸銨雖然不利于菌絲生長，但有利于該菌產孢，產孢量可達144.75×105個/mL，極顯著高于其他氮源處理的產孢量，而甘氨酸不利于該菌產孢。

2. 5. 6 致死溫度測定 經50和55 ℃處理10 min，該菌菌絲在PDA培養基上仍能再生長，但60～75 ℃處理10 min后菌絲均不再生長，由此認為該菌菌絲的致死溫度為60 ℃處理10 min。

3 討論

本研究分離獲得的菌株的ITS序列與基因庫中C. truncatum（登錄號：HQ896482）、C. capsici（登錄號：JX910365）的同源性均達100%，與Guo等（2014）報道一致。陳吳鍵（2007）研究發現，C. truncatum與C. capsici的菌落形態相似，但兩者間存在一些區別，如C. capsici在培養基中不產生菌核，而C. truncatum產生菌核。本研究在培養后期觀察到菌核。曾大興等（2004）研究認為，C. truncatum和C. capsici是同一個種，而傳統分類系統認為炭疽菌屬的種在一定寄主植物上嚴格專化。孫志峰等（2008）和樓兵干等（2009）認為引起大豆豆莢炭疽病的病原菌種名用C. truncatum比C. Capsici更貼切。Guo等（2014）和鄭偉等（2014）對引起火龍果果實炭疽病病原菌種名采用平頭炭疽菌（C. truncatum）而不是辣椒炭疽菌（C. capsici）。本研究交互接種結果顯示，從火龍果果實上分離的C. truncatum能侵染大豆豆莢和番茄果實，且發病快。此外，Von Arx（1970）認為炭疽菌的各形態單位在分類中的權重并不一樣，分生孢子和附著胞的形態和大小是鑒定分類中的主要形態特征，但分生孢子盤、剛毛、菌落、菌核也可作為病原菌鑒定的輔助依據。因此，本研究綜合考慮分生孢子、菌核與寄主特征、rDNA-ITS序列、系統發育樹分析及種名應用的穩定性，認為引起海南省火龍果果實炭疽病的另一種病原菌是C. truncatum。該菌對其他作物的致病性測定結果表明，其還可侵染大豆豆莢、番茄果實等，與已報道C. truncatum引起大豆豆莢炭疽病（樓兵干等，2009；肖杰文等，2011）、番茄炭疽?。―iao et al.，2014）一致。此外，C. truncatum也能引起豇豆莖炭疽?。ㄐ禧惢鄣龋?014）、棉花炭疽?。钣崖摰龋?014），但對該菌株的寄主范圍及?；腿孕柽M一步研究。

Guo等（2014）和鄭偉等（2014）分別對引起云南省、貴州省火龍果果實炭疽病病原進行鑒定，發現其病原菌為平頭炭疽菌（C. truncatum），但均未深入研究該菌生物學特性。本研究發現，火龍果平頭炭疽菌菌絲生長的適宜溫度為20～30 ℃，產孢適宜溫度為25～35 ℃，最適生長和產孢溫度均為30 ℃。Guo等（2014）認為該菌生長的最適溫度為25 ℃，本研究結果較其略高，究其原因可能是菌株來源的地區間差異所造成。該菌菌絲適宜生長pH為4～9，最適生長pH為8，產孢適宜pH為4～7，最適產孢pH為4，與孫志峰等（2008）對大豆C. truncatum研究結果略有不同，其認為C. truncatum適宜的生長pH為4～7，可能是由于C. truncatum在進化過程中受寄主或環境條件的選擇作用而產生變化。

該菌在以蔗糖和D-果糖作為碳源和以牛肉膏和蛋白胨作為氮源時菌絲生長最快，在無碳氮源時菌絲生長緩慢，菌絲稀疏，不易觀察，說明火龍果平頭炭疽菌的生長需要碳氮源。此外，可溶性淀粉為碳源、硝酸銨為氮源、酸性和黑暗條件下，均能促進該病原菌產孢。因此，在C. truncatum防治中要盡量避免其生長和產孢的有利條件。

4 結論

本研究結果表明，引起海南省火龍果果實炭疽病的另一種病菌原是平頭炭疽菌[C. truncatum（Schw.）Andrus & Moore]，該菌不僅侵染火龍果果實，還能侵染大豆豆莢和番茄果實。

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（責任編輯 麻小燕）