比清除率衡量Sevage法脫茶籽多糖蛋白的效果

張勇 周麗明 黃章平

摘要：【目的】以茶籽多糖對超氧陰離子自由基（■）的比清除率作為茶籽多糖脫蛋白效果的衡量指標，優化Sevage法脫茶籽多糖蛋白的工藝條件，為茶籽多糖的開發利用提供理論依據。【方法】采用Sevage法脫茶籽多糖蛋白，通過單因素試驗和正交試驗分析氯仿與正丁醇體積比、茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比、振蕩時間、靜置時間等因素對脫蛋白茶籽多糖對■的比清除率的影響；同時采用Schaal烘箱法研究茶籽多糖對油脂的抗氧化作用。【結果】Sevage法脫茶籽多糖蛋白的最佳工藝條件為：氯仿與正丁醇體積比4∶1、茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比3∶1、振蕩時間20 min、靜置時間20 min，在此條件下，茶籽多糖對■的比清除率為0.461 mL/mg。脫蛋白茶籽多糖對油脂的抗氧化活性較未脫蛋白茶籽多糖有明顯提高，且隨貯存時間的延長，抗氧化效果越明顯。【結論】茶籽多糖對■的比清除率可作為提高茶籽多糖抗氧化活性純化工藝條件的衡量指標；脫蛋白茶籽多糖具有一定的抗氧化作用，可作為油脂抗氧化劑進行深入研究。

關鍵詞： 茶籽多糖；比清除率；脫蛋白；Sevage法

中圖分類號： TS229 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）01-0107-05

0 引言

【研究意義】茶籽多糖因具有抗凝血、抗血栓（王淑如和王丁剛，1992）、降血糖（劉安軍等，2012）、清除羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（■）（劉茹和馬森，2012；胡平平等，2012）等生物功能而受到高度重視。從油茶餅粕中提取的茶籽多糖均含有一定量的蛋白，從而影響多糖的生物活性，因此，脫蛋白成為茶籽多糖精制中必不可少的環節。研究茶籽多糖脫蛋白的工藝條件及其抗氧化活性，對茶籽多糖的開發利用具有重要意義。【前人研究進展】目前關于茶籽多糖提取條件的研究已有一些報道。王瑾和周建平（2009）采用微波輔助提取茶籽多糖，其最佳提取條件為：料液比1∶5、微波功率600 W、提取時間9 min、pH 6。周麗明等（2013）采用回流法提取茶籽多糖，發現以55%乙醇溶液為提取劑，在料液比1∶12、回流溫度55 ℃的條件下回流提取2.0 h，茶籽多糖提取率為6.21%。關于多糖脫蛋白條件的研究也較多（張萍等，2013；孔繁東等，2014；常飛等，2015），但有關茶籽多糖脫蛋白條件及其抗氧化活性的詳細研究相對較少。安茂強（2009）對茶籽多糖的體外抗氧化活性進行研究，結果表明，茶籽多糖對·OH和■均有一定的清除效果。尹麗敏等（2012）采用鹽酸—乙醇等電點法脫油茶籽多糖蛋白，蛋白脫除率為92.68%，多糖保留率為61.78%。【本研究切入點】常規的多糖脫蛋白方法在脫去多糖中蛋白的同時會造成多糖損耗，故不能僅以脫蛋白后多糖殘留率或脫蛋白率作為該方法脫蛋白效果的衡量指標。考慮到茶籽多糖具有清除■的生物功能，且清除率與茶籽多糖的濃度呈正相關，本研究提出一個“比清除率”的概念，即將“比清除率（mL/mg）”定義為多糖溶液對■的清除率（%）與多糖濃度（mg/mL）的比值。以茶籽多糖脫蛋白前后對■的比清除率作為脫蛋白效果的衡量指標，直觀地表示茶籽多糖具有清除■的生物活性及清除強度。【擬解決的關鍵問題】通過單因素試驗和正交試驗，考察氯仿與正丁醇體積比、茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比、振蕩時間、靜置時間等因素對經Sevage法脫蛋白后的茶籽多糖對■比清除率的影響，確定最佳工藝條件；同時研究茶籽多糖對油脂的抗氧化作用，為尋找到合適、統一的茶籽多糖脫蛋白效果的衡量指標，以及茶籽多糖的應用研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

油茶餅粕由江西山之源山茶科技開發有限公司提供。食用調和油購自當地超市，葡萄糖、氯仿、正丁醇、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、鄰苯三酚、乙二胺四乙酸、檸檬酸、特丁基對苯二酚、濃硫酸、苯酚、乙醚、無水乙醇、丙酮等試劑均為分析純。主要儀器設備：UV-2102 PC型紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）、HH-6數顯恒溫水浴鍋（江西省博力儀器設備有限公司）、AL204型電子天平[梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]、SHZ-III型循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 苯酚—硫酸法制作葡萄糖標準曲線 配制質量濃度為0.250 mg/mL的葡萄糖標準液，參照周麗明和張勇（2015）的方法制作葡萄糖標準曲線。

1. 2. 2 Sevage法脫茶籽多糖蛋白 參照王艾平等（2012）的方法制備茶籽粗多糖溶液，將其10倍稀釋，即為茶籽多糖溶液。

1. 2. 3 茶籽多糖對■的比清除率計算 取20 mL茶籽多糖溶液，加入一定體積的Sevage試劑，室溫下振蕩一定時間后靜置一段時間，4000 r/min離心15 min，按1.2.1測定上清液中的多糖含量，參照周麗明等（2012）的方法測定上清液對■的清除率，然后計算茶籽多糖對■的比清除率。

1. 2. 4 單因素試驗 考察氯仿與正丁醇體積比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）、茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）、振蕩時間（10、20、30、40、50 min）、靜置時間（10、20、30、40、50 min）對茶籽多糖對■的比清除率的影響。

1. 2. 5 正交試驗 以茶籽多糖對■的比清除率為衡量指標，在單因素試驗的基礎上設計4因素3水平的L9（34）正交試驗，以優化脫蛋白工藝條件。

1. 2. 6 茶籽多糖脫蛋白前后對油脂的抗氧化性試驗 向茶籽多糖溶液和按Sevage法最佳工藝條件處理后的上清液中分別加入無水乙醇，使溶液中乙醇體積分數達85%，靜置過夜，離心后得沉淀，再以丙酮和乙醚分別洗滌沉淀，即為茶籽多糖和脫蛋白茶籽多糖。以30%乙醇為溶劑，配制多糖含量均為10 mg/mL的茶籽多糖溶液和脫蛋白茶籽多糖溶液，等比稀釋后可得5 mg/mL的茶籽多糖溶液和脫蛋白茶籽多糖溶液。

采用Schaal烘箱法研究茶籽多糖對食用油脂的抗氧化作用。準確稱取50.0 g食用調和油8份，分別置于250 mL錐形瓶中，其中2份分別加入1 mL的5 mg/mL茶籽多糖溶液和脫蛋白茶籽多糖溶液，使多糖添加量為0.01%；再取2份分別加入1 mL的10 mg/mL茶籽多糖溶液和脫蛋白茶籽多糖溶液，使多糖添加量為0.02%（王雙明，2013）；以不添加任何物質的食用調和油為空白對照；以添加1 mL 30%乙醇溶液的食用調和油為陰性對照；以分別加入1 mL 10 mg/mL檸檬酸和特丁基對苯二酚的30%乙醇溶液的食用調和油為陽性對照。同時設一組平行。將全部樣品混合均勻后置于（65±1）℃恒溫干燥箱中強化貯存，定時振蕩混勻并改變樣品在干燥箱中的相對位置，每隔2 d取樣1次，按照GB/T 5009.37-2003測定其過氧化值。

2 結果與分析

2. 1 葡萄糖標準曲線

從圖1可以看出，葡萄糖質量濃度在0～0.125 mg/mL范圍內與其吸光值呈良好的線性關系，線性回歸方程為：y=11.224x+0.0247（R=0.9967）。

2. 2 單因素試驗結果

2. 2. 1 氯仿與正丁醇體積比對茶籽多糖對■比清除率的影響 由圖2可知，在茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比2∶1、振蕩時間20 min、靜置時間20 min的條件下，隨著氯仿與正丁醇體積比的增大，茶籽多糖溶液對■的比清除率逐漸升高，體積比為4∶1時達最大值（0.423 mL/mg），超過4∶1后，比清除率有所下降。這可能是由于氯仿致使蛋白變性，隨著氯仿用量的增加，脫去的蛋白也增多，促使茶籽多糖的活性基團暴露，茶籽多糖對■的比清除率逐漸上升；但氯仿用量的進一步增加，茶籽多糖溶液與Sevage試劑的互溶程度有所降低，造成脫蛋白效果變差，從而導致比清除率下降。未經脫蛋白處理的茶籽多糖溶液對■的比清除率為0.156 mL/mg，低于脫蛋白處理后的茶籽多糖溶液的比清除率，說明脫除一部分蛋白有利于茶籽多糖對■的清除，增強其生物功能。因此，確定氯仿與正丁醇最佳體積比為4∶1。

2. 2. 2 茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比對茶籽多糖對■比清除率的影響 由圖3可知，在氯仿與正丁醇體積比4∶1、振蕩時間20 min、靜置時間20 min的條件下，隨著茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比的增大，茶籽多糖溶液對■的比清除率逐漸升高，當體積比為3∶1時達最大值（0.451 mL/mg），體積比超過3∶1后，比清除率逐漸降低。這可能是因為Sevage試劑加入量過少而造成蛋白脫除較少，故茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比以3∶1為合適。

2. 2. 3 振蕩時間對茶籽多糖對■比清除率的影響 由圖4可知，在氯仿與正丁醇體積比4∶1、茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比3∶1、靜置時間20 min的條件下，當振蕩時間為20 min時，茶籽多糖溶液對■的比清除率達最大值（0.448 mL/mg），繼續延長振蕩時間則導致比清除率下降，可能是由于振蕩時間過長造成茶籽多糖的損失增加。因此，確定最佳振蕩時間為20 min。

2. 2. 4 靜置時間對茶籽多糖對■比清除率的影響 由圖5可知，在氯仿與正丁醇體積比4∶1、茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比3∶1、振蕩時間20 min的條件下，當靜置時間為20 min時，茶籽多糖溶液對■的比清除率達最大值（0.452 mL/mg）；繼續延長靜置時間，茶籽多糖對■的比清除率下降，但下降趨勢變緩。這可能是因為靜置時間較短時，適當延長靜置時間有利于蛋白的脫除和沉淀；但靜置時間過長后，茶籽多糖損失增加，茶籽多糖溶液與Sevage試劑分層，從而造成脫蛋白效果有所下降。因此，確定最佳靜置時間為20 min。

2. 3 正交試驗結果

由表1可知，影響茶籽多糖對■比清除率的因素主次排序為：氯仿與正丁醇體積比>茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比>振蕩時間>靜置時間。根據k值判定，茶籽多糖脫蛋白的最佳工藝組合為A2B2C2D2，即氯仿與正丁醇體積比4∶1、茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比3∶1、振蕩時間20 min、靜置時間20 min。按此條件進行試驗，茶籽多糖對■的比清除率為0.461 mL/mg，高于正交試驗任一組合的比清除率，因此，確定通過正交試驗優化得到的條件為Sevage法脫茶籽多糖蛋白最佳工藝條件。

2. 4 茶籽多糖脫蛋白前后對油脂的抗氧化作用

由圖6可知，茶籽多糖在脫蛋白前后對油脂均有一定的抗氧化作用，但以脫蛋白茶籽多糖對油脂的抗氧化作用明顯強于未脫蛋白的茶籽多糖，與茶籽多糖對■的比清除率試驗結果相一致。但茶籽多糖對油脂的抗氧化作用稍弱于傳統的油脂抗氧化劑——檸檬酸和特丁基對苯二酚。

3 討論

本研究通過單因素試驗和正交試驗，優化得到以茶籽多糖對■比清除率為衡量指標的Sevage法脫茶籽多糖蛋白最佳工藝條件為：氯仿與正丁醇體積比4∶1、茶籽多糖溶液與Sevage試劑體積比3∶1、振蕩時間20 min、靜置時間20 min，在此條件下，多糖溶液對■的清除率為4.31%；當茶籽多糖質量濃度為0.0935 mg/mL時，其對■的比清除率為0.461 mL/mg；而未經脫蛋白處理的茶籽多糖溶液對■的清除率為2.02%，茶籽多糖質量濃度為0.129 mg/mL，其對■的比清除率為0.156 mL/mg，多糖保留率約72%。本研究結果較尹麗敏等（2012）研究得到的61.78%油茶籽多糖保留率高，且本研究的脫蛋白工藝時間也較其3 d的靜置時間大幅縮短；與張萍等（2013）的研究結果相比，本研究的工藝條件略有不同，多糖損失率高于其8.05%的多糖損失率，可能與所處理的多糖種類不同有關。脫蛋白處理雖然造成茶籽多糖有所損失，但茶籽多糖對■的清除率提高了113%，對■的比清除率提高了195%。

本研究還發現，脫蛋白茶籽多糖對油脂的抗氧化作用明顯強于未經脫蛋白處理的茶籽多糖，說明Sevage法脫茶籽多糖蛋白能有效提高茶籽多糖的抗氧化活性，加強其生物功能。但茶籽多糖對油脂的抗氧化作用稍弱于傳統的油脂抗氧化劑——檸檬酸和特丁基對苯二酚，可能與茶籽多糖的加入劑量及純度有關。茶籽多糖屬于天然產物，可以考慮通過增加其添加量以提高對油脂的抗氧化效果，如借鑒潘月等（2015）對竹葉多糖分離純化的方法對茶籽多糖進行分離純化，可能會獲得抗氧化效果較強的組分；也可考慮借鑒李馥邑等（2014）對玉米皮多糖進行硫酸酯化的方法處理茶籽多糖以增強其抗氧化活性，下一步將對這兩方面進行深入研究。

4 結論

茶籽多糖對■的比清除率能直觀反映茶籽多糖的抗氧化性，可作為提高茶籽多糖抗氧化活性純化工藝條件的衡量指標；茶籽多糖經Sevage法脫蛋白處理后的抗氧化活性有所提高，可將其作為油脂抗氧化劑進行深入研究。

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（責任編輯 羅 麗）