長期繼代蝴蝶蘭類原球莖對抗氧化劑的生理響應及DNA穩(wěn)定性分析

劉福平　陳淳　林志楷

摘 要 為了解抗氧化劑減緩長期繼代蝴蝶蘭類原球莖衰老的機理，本實驗在培養(yǎng)基添加抗氧化劑100 mg/L半胱氨酸和8 g/L甘露醇繼代類原球莖24個月，分析其相關氧化指標及DNA穩(wěn)定性。結果表明，類原球莖培養(yǎng)期間處理組總活性氧水平變化趨勢與對照組不同，處理組比對照組低，對照組總活性氧水平消長趨勢與超氧陰離子（O2·- ）生成速率較為一致，處理組則與羥自由基（·OH）相對含量的消長趨勢較一致。繼代期間丙二醛含量變化趨勢與總活性氧水平變化趨勢相似，處理組比對照組低。類原球莖DNA的SRAP分析結果表明，繼代培養(yǎng)期間處理組與對照組間均未發(fā)生明顯的DNA差異。類原球莖DNA甲基化程度變化趨勢與總活性氧水平變化大體相同，中后期處理組比對照組低。

關鍵詞 蝴蝶蘭；類原球莖；長期繼代；抗氧化劑；氧化指標；DNA穩(wěn)定性

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Abstract To understand the mechanism that antioxidants slowed down the aging of Phalaenopsis PLB through long-term subculture， PLB were subcultured for 24 months in the culture supplemented with antioxidants（100 mg/L cysteine and 8 g/L mannitol）， and the related oxidant indexes and DNA stability of PLB were analyzed in the experiment. The results showed that during subculturing of PLB the variation tendency of levels of total reactive oxygen species（T-ROS）was not consistent between the control and the treatment. The T-ROS levels of the treatment were lower than that of the control. During PLB subculturing， the variation tendency of the levels of T-ROS in the control was consistent with that of the growth rate of superoxide anion（O2·- ）， but it accorded with the relative quantity of hydroxyl radical（·OH）in the treatment. The changes of malondialdehyde content were generally consistent with the levels of T-ROS during subculturing， the contents were lower in the treatment than that in the control. The result of SRAP analysis on genome DNA indicated the polymorphic difference did not show clearly in the PLB throughout subculturing， as well as between the control and the treatment. The variation tendencies of levels of DNA methylation of PLB and the levels of T-ROS were about the same. However， the levels in the treatment were lower than that in the control at middle-late stage.

Key words Phalaenopsis spp.； PLB； Long-term subculture； Antioxidants；Oxidant index；DNA stability

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.015

植物組培的中間繁殖體（愈傷組織等）隨著繼代培養(yǎng)時間延長，其增殖、分化能力逐漸降低已有許多報道[1]。類原球莖（PLB）是蘭科植物組培的主要中間繁殖體，其長期繼代培養(yǎng)的研究已有少量報道，如采用無激素培養(yǎng)基有利于蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）某些品種類原球莖長期繼代，其分化的植株表觀性狀穩(wěn)定[2-3]，分別調節(jié)培養(yǎng)基激素及糖濃度有利于長期繼代的春石斛類原球莖增殖和生根[4]，長期繼代培養(yǎng)物的變異近年來主要采用分子標記檢測，如春蘭克隆繁殖苗[5]，鐵皮石斛叢芽擴繁的分生苗[6]、霍山石斛愈傷組織[7]、霍山石斛類原球莖[8]等。

筆者以常規(guī)方法繼代培養(yǎng)蝴蝶蘭類原球莖24個月，增殖和分化能力有所降低，在培養(yǎng)基添加100 mg/L半胱氨酸與8 g/L甘露醇組合的抗氧化劑處理，雖然繼代培養(yǎng)后增殖和分化能力也有所降低，但比對照（常規(guī)培養(yǎng)基）類原球莖增殖能力顯著提高，萌發(fā)率極顯著提高。關于植物組培中長期繼代中間繁殖體的衰老或退化現象，普遍認為是活性氧自由基致酶失活，影響生理代謝，啟動膜脂過氧化連鎖反應、破壞核酸結構等所致[9-10]，即自由基在植物生理衰老和遺傳變異上均有重要的效應。筆者研究在培養(yǎng)基添加抗氧化劑長期繼代蝴蝶蘭類原球莖的相關氧化指標和DNA穩(wěn)定性變化，以初步了解抗氧化劑減輕類原球莖衰老的生理及分子機理。

1 材料與方法

1.1 材料

蝴蝶蘭瓶苗（YZ45）由福建省亞熱帶植物研究所組培室提供。以嫩葉切塊為外植體，誘導培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 8 mg/L+CW（椰子汁）20%（V/V）+ 蔗糖2%（W/V），誘導出的PLB轉接到1/2MS+6-BA 3 mg/L+CW 20%（V/V）+蔗糖2%（W/V）培養(yǎng)基擴繁，獲得大量PLB作為實驗材料。培養(yǎng)條件均為光照1 500 lx，12 h/d，溫度24～26 ℃。

1.2 方法

1.2.1 類原球莖長期繼代方法 將PLB接種于繼代培養(yǎng)基1/2MS+CW 20%（V/V）+蔗糖2%（W/V），每瓶鮮重3.00 g，培養(yǎng)2個月，隨機取9瓶稱量每瓶PLB鮮重，作為增殖能力指標。將PLB團剝離出中等大小單粒PLB，接種到分化培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 3 mg/L+CW 20%（V/V）+NAA 0.5 mg/L+蔗糖2%（W/V），每瓶接種10粒，培養(yǎng)2個月（以上培養(yǎng)條件均同1.1），隨機取9瓶觀測顏色變化，PLB存活率為仍呈綠色的PLB數/總PLB數×100%，分化率為出芽長根PLB數/總PLB數×100%。

PLB長期繼代培養(yǎng)方法，對照組為上述繼代培養(yǎng)基配方，處理組為對照組培養(yǎng)基添加抗氧化劑半胱氨酸100 mg/L培養(yǎng)基和甘露醇8 g/L培養(yǎng)基。每瓶接種PLB起始鮮重3.00 g，每 2 個月繼代分瓶1次。在培養(yǎng)的第8、16、24個月，檢驗PLB增殖能力，方法為每處理取PLB鮮重3.00 g接種于繼代基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)2個月（以上培養(yǎng)條件均同1.1）每處理隨機取9瓶觀測每瓶PLB鮮重，PLB成活率和分化率觀測計算方法同上。

取培養(yǎng)的第0、8、16、24個月PLB進行生理生化指標、DNA穩(wěn)定性分析。

1.2.2 生理指標分析

（1）總活性氧（T-ROS）水平。ELISA檢測試劑盒由上海博舜生物科技有限公司提供，取0.5 g鮮PLB于500 μL生理鹽水研磨，其他按說明書操作，450 nm處測吸光值。標準曲線y=771.3x-41.21（R2=0.991），活性氧水平以U/mL表示。

（2）羥自由基（·OH）相對含量。按劉福平等[11]介紹的方法。以單位時間每克鮮重在420 nm處的吸光度變化為單位， 即ΔA420/（min·g FW）。

（3）超氧陰離子（O2·- ）生成速率。參照湯章成[12]的方法，同時做NO2-標準曲線，得y= 48.539 1x+1.170 3（R2=0.998 2），結果以μmol/（min·g FW）表示。

（4）過氧化氫（H2O2）含量。按宋松泉等[13]及沈文飚等[14]介紹的方法， 同時做H2O2標準曲線，得y=1 426.5x+0.357 2（R2=0.996），結果以μmol/g FW 表示。

（5）丙二醛（MDA）含量。按湯章成的方法[12]，結果以μmol/g FW表示。

1.2.3 DNA變異分析

（1）SRAP（相關序列擴增多態(tài)性）檢測。取蝴蝶蘭瓶苗嫩葉及繼代培養(yǎng)第0、8、16、24個月的PLB進行SRAP檢測。DNA提取采用CTAB法，純度、濃度檢測以A260和A280檢測吸光度法和瓊脂糖凝膠電泳法。按照Li和Quiros[15]的SRAP引物設計原則設計引物。SRAP-PCR體系（25 μL）包括模板DNA 40 ng、Mg2+ 2.0 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq酶1 U。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5個循環(huán)；94 ℃ 1 min，50 ℃1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳及成像。

（2）DNA胞嘧啶甲基化水平。以培養(yǎng)第0、8、16、24個月的PLB為材料。DNA提取、水解、高效液相色譜參照劉福平等[16]介紹的方法。樣品在25 ℃下注入HPLC（Waters2695）的Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.0 mm，5μm）（大連伊利特分析儀器有限公司提供）分離， 柱溫25 ℃。流動相由甲醇、戊烷磺酸鈉（10 mmol/L）、三乙胺按體積比3 ∶ 90 ∶ 0.2配成，pH4.0，流速1.0 mL/min。胞嘧啶（C）及5-甲基胞嘧啶（5 mC）購自SIGMA公司，檢測波長273 nm，分別取胞嘧啶和甲基胞嘧啶系列標準溶液進行測定，以峰面積（S）對標準進樣量（摩爾數，M）作回歸方程，胞嘧啶回歸方程為MC=3.054×10-10×SC-1.598×10-5，R2=0.999 6，甲基胞嘧啶回歸方程M5 mC=5.684×10-10×S5 mC+2.973×10-5，R2=0.999 7。根據PLB樣品DNA水解產物中C和5 mC的洗脫峰面積，計算樣品中C和5 mC的摩爾數，DNA甲基化水平=5 mC/（C+5 mC）×100%。

1.3 數據分析

對照組、處理組分別在不同培養(yǎng)時間觀測數據的組間差異顯著性比較按Dunnett最小顯著差數（DLSD）測驗法。同一培養(yǎng)時間的對照組與處理組間差異顯著性比較采用t檢驗法。

2 結果與分析

2.1 抗氧化劑對長期繼代類原球莖氧化指標的效應

培養(yǎng)基添加抗氧化劑繼代培養(yǎng)蝴蝶蘭PLB 24個月，總活性氧、羥自由基（·OH）相對含量、超氧陰離子（O2·- ）生成速率、過氧化氫（H2O2）含量和丙二醛（MDA）含量變化見表1。

2.1.1 總活性氧（T-ROS）水平變化 培養(yǎng)起始（0個月）PLB的總活性氧水平67.62 U/mL，培養(yǎng)第8個月，對照組顯著提高，處理組極顯著降低，隨后兩組都隨繼代培養(yǎng)時間延長升高，都達極顯著水平。培養(yǎng)期間3個時間點，處理組總活性氧水平均較對照組極顯著降低。

2.1.2 羥自由基（·OH）相對含量變化 培養(yǎng)起始（0個月）PLB的·OH相對含量0.503 ΔA420/（min·g FW），培養(yǎng)第8個月，對照組變化不明顯，處理組顯著降低，隨后兩組都隨培養(yǎng)時間延長而升高，第16個月，都顯著升高，第24個月都極顯著升高。處理組和對照組比較，培養(yǎng)第8個月，處理組較對照顯著降低，第16個月差異不顯著，第24個月較對照組極顯著降低。

2.1.3 超氧陰離子（O2·- ）生成速率變化 培養(yǎng)起始（0個月）PLB的O2·- 生成速率1.593 μmol/（min·g FW），培養(yǎng)第8個月，對照組顯著提高、處理組沒顯著變化，隨后都隨培養(yǎng)時間延長升高，第16、24個月，兩組都較初代極顯著升高。培養(yǎng)第8個月處理組較對照顯著降低，第16個月極顯著降低，第24個月差異不顯著。

2.1.4 過氧化氫（H2O2）含量變化 培養(yǎng)起始（0個月）PLB的H2O2含量為134.7 μmol/g FW，培養(yǎng)第8個月，對照組H2O2含量沒顯著差異，處理組顯著降低，第16個月兩組都極顯著升高，第24個月對照組仍極顯著升高，處理組有所回落，但仍較初代顯著升高。培養(yǎng)第8個月，處理組較對照極顯著降低，第16個月顯著升高，第24個月顯著降低。

2.1.5 丙二醛含量變化 培養(yǎng)起始（0個月）PLB的丙二醛含量為1.203 μmol/g FW，培養(yǎng)第8個月，對照組、處理組均沒明顯變化，第16個月對照組極顯著升高，處理組顯著升高，第24個月都極顯著升高。處理組和對照組比較，培養(yǎng)第8、16個月，處理組均較對照顯著降低，第24個月則極顯著降低。

從上所述可以看出，在整個培養(yǎng)期間，對照組總活性氧水平消長趨勢與O2·- 生成速率都隨培養(yǎng)時間延續(xù)而升高，趨勢相對較為一致，處理組總活性氧水平先抑后揚，與·OH相對含量消長趨勢較為一致。對照組丙二醛含量隨培養(yǎng)時間延續(xù)而升高，與總活性氧水平變化趨勢較一致，處理組丙二醛含量與總活性氧水平都是先抑后揚（但丙二醛含量在第8個月的降低沒有達到顯著水平），大體上較為協(xié)同。

2.2 抗氧化劑對長期繼代類原球莖的DNA變異的效應

2.2.1 DNA的SRAP分析 SRAP-PCR 擴增結果見圖1。1號為用于誘導PLB的瓶苗葉片，2號為培養(yǎng)初始的PLB，3～5號為對照組分別在8、16、24個月PLB，6～8號為處理組分別在8、16、24個月PLB。所有樣品擴增條帶大小在50～1 000 bp之間，擴增條數在2～6條之間，各樣品間呈現一定的多態(tài)性。1號葉子PCR結果明顯與2～8號PLB不同，其中有4條帶都與其他樣品不同，多態(tài)性差異明顯，說明從葉子誘導出PLB就有DNA水平變異。2～8號條帶相近，說明繼代培養(yǎng)期間PLB并未發(fā)生明顯的DNA差異，培養(yǎng)基添加抗氧化劑與對照PLB也并未發(fā)生明顯的DNA差異。

2.2.2 DNA甲基化水平分析 培養(yǎng)基添加抗氧化劑長期繼代培養(yǎng)PLB期間DNA胞嘧啶甲基化程度變化見表2。從表2可以看出， 培養(yǎng)起始PLB的DNA甲基化程度為17.7%，對照組和處理組在第8個月都沒顯著變化，隨著繼代培養(yǎng)時間延長，DNA甲基化程度逐漸提高，都達極顯著水平。處理組、對照組甲基化程度在第8個月差異不顯著，在第16個月處理組極顯著降低，第24個月顯著降低。

3 討論與結論

自由基在生理衰老和遺傳變異上均有重要的效應[9-10]，本實驗繼代培養(yǎng)蝴蝶蘭PLB，添加抗氧化劑處理組、對照組總活性氧水平都有所提高，處理組與同時點的對照相比都較低，即半胱氨酸與甘露醇復合抗氧化劑能降低PLB總活性氧水平。整個培養(yǎng)期間總活性氧水平變化趨勢與主要活性氧指標之間的關系，對照組總活性氧與O2·- 消長趨勢相對較為一致，推測O2·- 是總活性氧水平變化的主要影響因素，處理組·OH消長趨勢與總活性氧相對較為一致，·OH可能是主要影響因素，主要影響因素不同，可能因處理組在培養(yǎng)基添加抗氧化劑所致。膜脂過氧化產物丙二醛干擾細胞代謝活動，破壞生物膜結構，李仲芳等[17]在連續(xù)繼代培養(yǎng)鵝掌楸叢生芽中，O2·- 和丙二醛含量呈現逐漸增加的趨勢。本實驗PLB繼代培養(yǎng)期間，對照組、處理組丙二醛含量變化趨勢都與總活性氧變化相似，處理組丙二醛含量較同時期的對照組低，說明抗氧化劑對降低PLB丙二醛含量有一定的效果。

PLB的SRAP-PCR擴增結果，葉子PCR結果與所有PLB多態(tài)性明顯， 說明從葉子誘導出PLB就有DNA水平變異。所有PLB擴增條帶相近，說明繼代培養(yǎng)期間PLB并未發(fā)生明顯的DNA差異，培養(yǎng)基抗氧化劑也并未導致明顯的DNA差異。長期繼代的組培無性系在分子水平無明顯變異已有一些報道，葉藝春蘭克隆繁殖的第9代到第20代組培苗DNA分析未見明顯差異[5]，鐵皮石斛的7代無性繁殖苗，第4代之后代間僅有部分引物RAPD帶型發(fā)生甚微變化[6]，從繼代18次霍山石斛PLB分化的幼苗RAPD分析，不同代PLB的幼苗之間、長期繼代與供體母株之間均沒有顯著遺傳變異[8]，其他如長期繼代再生能力喪失的紐荷爾臍橙愈傷組織[18]，長期繼代蛇麻草愈傷組織再生苗[19]，繼代5次的滇黃芩組培苗[20]都沒檢出明顯帶型差異。

在植物離體培養(yǎng)過程中，遺傳和表觀遺傳變異都可能是引起長時間培養(yǎng)材料喪失分化能力的一個重要原因[1，21]，有報道DNA甲基化水平隨著繼代代數和時間的增加而增加[18，22，23]，本實驗的PLB在培養(yǎng)的第16、24個月，處理組、對照組的DNA甲基化水平都較初代提高，但對照組或處理組的SRAP檢測未發(fā)現明顯變異，上述的紐荷爾臍橙、蛇麻草事例中，采用分子標記均未檢測出多態(tài)性條帶，紐荷爾臍橙愈傷組織胚狀體再生能力喪失，作者認為可能是相關基因發(fā)生甲基化修飾造成的[18]，蛇麻草也檢測出了甲基化變化，認為這種變化是逐漸形成[19]。

氧化脅迫（活性氧）誘發(fā)DNA甲基化程度提高或降低各有報道[24]，本實驗不管是對照組還是處理組，在繼代培養(yǎng)中后期，PLB的DNA甲基化程度提高，與總活性氧水平逐漸提高大體對應，至于添加抗氧化劑（含半胱氨酸和甘露醇）處理組DNA甲基化程度較對照組低，杜亞瓊等[25]報道50 mmol/L甘露醇對擬南芥種子萌發(fā)率、幼苗生長幾乎沒影響，基因組DNA甲基化水平均低于對照，有報道葫蘆巴堿、甜菜堿和膽堿[26]、茶多酚類[27]具有去甲基化效應，而它們都具較強抗氧化性，所以，本實驗中抗氧化劑可能與PLB的DNA甲基化程度降低有關。

活性氧自由基在植物生理衰老和遺傳變異上均有重要的效應。本實驗的生理指標方面，抗氧化劑使繼代培養(yǎng)類原球莖總活性氧水平降低，從而丙二醛含量也降低，減輕了丙二醛對細胞生理毒害，有利于減輕繼代蝴蝶蘭類原球莖增殖、分化能力下降。類原球莖DNA穩(wěn)定性分析未發(fā)現明顯多態(tài)性，即核苷酸序列并沒有檢出變異，處理組DNA甲基化程度較對照組低，可能也是抗氧化劑減輕長期繼代蝴蝶蘭類原球莖增殖、分化能力下降的原因之一。本研究結果為克服長期繼代蝴蝶蘭類原球莖應用上存在障礙的研究提供借鑒，也為利用化學調控解決或緩解植物培養(yǎng)物長期繼代的衰老研究提供基礎。

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責任編輯：沈德發(fā)