木薯MeNRT2.1基因的克隆及表達分析

胡春吉　鄒良平　彭明

摘 要 木薯具有產量高、抗貧瘠等特點，為了了解其耐貧瘠的作用機理，提高木薯在貧瘠土壤中對氮素的利用率，以培養20 d的“華南5號”木薯組培苗為實驗材料，采用同源克隆和RT-PCR技術，獲得一個高親和硝態氮轉運蛋白（NRT2）基因，命名為MeNRT2.1，該基因含有1 593 bp的開放閱讀框架，編碼530個氨基酸。生物信息學分析結果表明，木薯MeNRT2.1與苜蓿、擬南芥、可可、楊樹等物種的NRT2.1同源性高，其中與可可樹TcNRT2.1的親緣關系最近，氨基酸相似性達到90%。實時熒光定量PCR檢測結果表明，MeNRT2.1在木薯組培苗的根中表達，并且在NO3-濃度為0.2 mmol/L時，其相對表達量較高，NO3-濃度為10 mmol/L時其相對表達量較低，NO3-濃度為0時幾乎不表達；MeNRT2.1在莖、葉中也幾乎不表達，即該基因具有誘導型組織特異性表達模式。原生質體瞬時表達發現MeNRT2.1定位在細胞膜上。此研究為進一步通過NRT2基因提高木薯的抗逆性奠定了基礎。

關鍵詞 木薯；硝態氮；NRT2；實時熒光定量PCR；亞細胞定位

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A

Abstract Cassava（Manihot esculenta Crantz）has several agronomic traits like a high yield combined with low-nutrient soils tolerance. To insight into the molecular basis for tolerance of poor soils and improve the utilization rate of nitrate in cassava，the“Huanan 5”cassava cultivar grown for 20 days in a medium containing different nitrate concentrations was used as the experimental material in this study. The full-length cDNA encoding a high-affinity nitrate transporter gene， designated MeNRT2.1，was isolated from cassava by using homologous cloning and RT-PCR techniques，MeNRT2.1 was 1 899 bp in length and contained an open reading frame of 1 593 bp. Sequence analysis revealed that the ORF of MeNRT2.1 encoded 530 amino acid residues. Phylogeneticanalyses showed that MeNRT2.1 was highly homologous to MtNRT2，AtNRT2，TcNRT2 and PtNRT2. The closest homolog of MeNRT2.1 is Theobroma cacao NRT2.1，with 90% amino acid identity. Quantitative real-time PCR analysis showed that the MeNRT2.1 transcript of root under 0.2 mmol/L NO3-1 treatment was the highest among the three nitrate concentrations，and had a low level on 10 mmol/L in root. However，there was almost no level without nitrate in root. Little MeNRT2.1 mRNA was found in other examinated tissues. Therefore，the expression of MeNRT2.1 is induced and specific pattern. Subcellular localization of the fusion protein of MeNRT2.1 with GFP only appeared in the cytomembrane. It provides an important foundation for future studies of regulation under the condition of poor stress about this gene.

Key words Cassava；Nitrate nitrogen；NRT2；Quantitative real-time PCR；Subcellular localization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.020

木薯（Manihot esculenta Crantz）屬于大戟科木薯屬植物，起源于熱帶美洲，既是世界三大薯之一[1]，也是全球六大糧食作物之一。木薯具有高光效、高淀粉產量、抗旱、耐貧瘠等特點，即使在非常貧瘠的土地上也能獲得一定的產量[2]。而氮素是植物生長發育過程中必需的大量元素之一，同時也是組成植物體內蛋白質、核酸、磷脂、酶類和維生素、生物堿、葉綠素以及其他數千種物質的重要成分之一[3]。植物體內的氮素水平直接或間接影響植物的生理生化過程及生長發育[4]，而氮素對木薯產量的貢獻率可達50%以上[5]。

NO3-和NH4+是植物根系從土壤中獲得氮素的最主要的2種形式。根系中NO3-的吸收與轉運是由硝酸鹽轉運體（Nitrate transporters， NRTs）實現的[6]，當外界可利用的NO3-濃度低時（<1 mmol/L），其吸收主要依靠高親和轉運體系（the high-affinity transport system HATS）完成；當外界可利用NO3-濃度高時（>1 mmol/L），其吸收主要依靠低親和轉運體系（the low-affinity transport system LATS）完成[7-8]。

到目前為止，前人已經從擬南芥中鑒定出53個低親和（NRT1）與7個高親和（NRT2）NO3-轉運蛋白基因[9]。NO3-在100～50 mmol/L時，基因表達量與NO3-吸收量的相關系數說明高親和與低親和的轉運系統中主要是AtNRT2.1和AtNRT1.1在起作用[10]。AtNRT2.1在根中強烈表達，Wirth等[11]通過綠色熒光蛋白融合和免疫學方法研究發現，AtNRT2.1主要定位于擬南芥根皮層和表皮的質膜上。Hu等[12]研究表明水稻Nrt1.1B定位于細胞膜，對NO3-從根到葉的運輸有重要作用，提高了粳稻對硝酸鹽的利用率。徐海榮等[13]發現在不同氮源及不同氮濃度條件下，OsNrt2.1在水稻根中的表達均高于葉，表明OsTNrt2.1對根系吸收NO3-可能具有重要作用。Quesada等[14]通過Northern雜交發現，NpNRT2.1在煙草根中強烈表達。Amarasinghe等[15]發現，通過低濃度硝酸鹽誘導，GmNRT2基因在大豆根中表達強烈，屬于HATS。孔敏等[16]研究表明，白菜BcNRT2在白菜根部的表達量最高，而且在高低2種濃度的NO3-處理下均具有較高水平的表達量。同樣，在大麥[17]、玉米[18]等植物中也克隆鑒定出了NRT2基因。而關于木薯中硝態氮轉運蛋白基因家族的報道卻很少。

本研究成功克隆出了木薯MeNRT2.1基因的編碼序列，并對其序列特征及時空表達情況進行了研究分析，為該基因的進一步應用以及木薯NO3-吸收轉運積累機制的深入研究提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料“華南五號”木薯（Manihot esculenta Crantz）由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所提供。

1.1.2 菌種、質粒和試劑 大腸桿菌（E. coli） DH5α、pCAMBIA1302植物表達載體由本實驗室保存。PMD18-T載體、限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、實時熒光定量PCR試劑SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ等均購自TaKaRa公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自中科瑞泰公司。反轉錄試劑FastQuant RT Kit購自天根生化科技有限公司。其它生化試劑和常規試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 木薯組培苗硝態氮誘導處理 將發育狀態基本一致的木薯組培苗在KNO3梯度培養基中進行處理，培養基KNO3濃度依次為0、0.2、10 mmol/L。植株幼苗生長條件為光周期12 h/12 h，溫度25 ℃，相對濕度50%。幼苗培養20 d后，采集各處理根、莖、葉作為試驗材料，用液氮速凍后將其儲存于-80 ℃冰箱內，備用。

1.2.2 RNA的提取純化及cDNA的合成 參照阮孟斌等[19]提取總RNA的方法提取“華南5號”木薯組培苗樣品根、莖、葉的總RNA，并使用1.0%瓊脂糖凝膠對RNA質量進行電泳檢測。使用FastQuant RT Kit對RNA進行純化，并將其反轉錄成cDNA。

1.2.3 木薯MeNRT2.1基因編碼序列的克隆 根據已報道的擬南芥AtNRT2.1基因，利用BioEdit與木薯全基因組進行BLAST檢索，初步獲得木薯NRT2基因，根據JGI（http：//www.phytozome.net/search.php）中收錄的MeNRT2.1（cassava4.1_031095m）

DNA序列為參考，采用Primer Premier 5引物設計軟件設計MeNRT2.1基因的上下游引物，在上游引物5′端引入保護堿基、BglⅡ酶切位點和補充堿基G，在下游引物5′端引入保護堿基和SpeⅠ酶切位點。引物序列如下：

P1 5′-GGAAGATCTGATGGCTGATATTGAGG

GTTCTC-3'（Bgl Ⅱ）

P2 5′-GGACTAGTGACATGGACTGGTGTAGTG

TTCG-3′（SpeⅠ）

以低濃度KNO3誘導的木薯組培苗根部cDNA 第一鏈為模板進行擴增。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 110 s，共35個循環；72 ℃ 10 min。反應結束后將PCR產物移至1%的瓊脂糖凝膠中，電泳檢測是否有特異條帶出現，對特異條帶進行回收。依照PMD18-T Vector Cloning Kit，將PCR回收產物與pMD18-T載體進行連接，采用熱激法將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取單菌落搖菌，進行菌液PCR檢測，將獲得的PCR陽性克隆命名為pMD18T-MeNRT2.1，送往上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4 木薯MeNRT2.1基因序列特點及其氨基酸序列進化分析 根據JGI公布的MeNRT2.1基因DNA序列及cDNA序列，利用NCBI Spidey （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/）分析基因結構。利用DNAMAN繪制基因結構圖，推導出氨基酸序列。基因編碼蛋白的理化性質預測采用ExPASy Proteomics Server 提供的在線工具Protpar-

am（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）。采用在線工具（http：//www.predictprotein.org/）進行二級結構分析。利用PSORT（http：//psort.hgc.jp/form.html）進行亞細胞定位預測。利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白質的跨膜區。利用MEGA 5.1軟件，以鄰位相近法（Neighbor-Joining）構建進化樹。

1.2.5 綠色熒光蛋白（GFP）融合載體的構建及鑒定 將序列正確的含有pMD18T-MeNRT2.1的大腸桿菌抽取質粒，用BglⅡ/SpeⅠ雙酶切對重組質粒進行酶切鑒定；將MeNRT2.1基因的全長CDS連接到含有GFP的植物表達載體pC1302，把連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，經Kan抗性篩選，挑取單克隆，再次用基因特異引物進行菌落PCR鑒定[20]，抽取質粒并進行雙酶切鑒定，構建出正確的GFP融合載體pC1302- MeNRT2.1（圖1）。以pC1302空載體作為對照。

1.2.6 煙草原生質體的分離和轉化 取健康煙草葉片用無菌水洗凈，使用刀片將葉片切成1 mm左右的細條，將其置于酶解液中，抽真空10 min，于23 ℃ 暗培養6 h。煙草葉肉原生質體的分離、酶解液及W5反應液的配制參照Sheen[21]的方法。原生質體轉化參考Yoo等[22]的PEG轉化擬南芥原生質體的方法。待轉化細胞暗培養24 h左右，用OLYMPU激光共聚焦顯微鏡（FV1000）觀察原生質體中的熒光分布。

1.2.7 木薯MeNRT2.1基因實時定量PCR分析

利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）的方法檢測木薯MeNRT2.1基因在不同濃度KNO3中根部的表達情況。根據熒光定量引物設計規則，在此基因非保守區域內設計MeNRT2.1的定量引物，以木薯MeACT基因作為目標基因定量表達的內參基因，引物序列見表1，以反轉錄cDNA為模板進行Real-time PCR，樣本和內參分別設置3個重復。依據TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）說明書進行，擴增程序為：第一步預變性，95 ℃ 30 s；第二步，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環45次。

1.3 數據分析

試驗數據通過Excel進行分析，獲得MeNRT2.1的相對表達量。RNA-seq高通量測序由北京諾和致源生物信息科技有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 MeNRT2.1基因cDNA的克隆

以JGI（http：//www.phytozome.net/search.php）中收錄的MeNRT2.1（cassava4.1_031095m）DNA序列為參考設計引物，以反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增，結果見圖2，經測序可知獲得1 593 bp含有完整編碼序列的cDNA序列，命名為MeNRT2.1。

2.2 MeNRT2.1編碼蛋白特性分析

MeNRT2.1基因全長1 899 bp，含有2個外顯子，1個內含子（圖3），含有1 593 bp的開放式閱讀框架（Open reading frame，ORF），編碼530個氨基酸（圖4）。基因編碼蛋白的理化性質預測采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam，推測其蛋白相對分子質量為57.26 ku，等電點為9.28。在組成 NRT2.1蛋白的20種氨基酸中，Gly所占比例最高，為10.6 %；His所占比例最低，為1.5%。帶正電殘基（Arg+Lys）為39，負電殘基（Asp+Glu）為27。該蛋白的不穩定系數為40.61，脂肪系數為89.11，親水性系數為0.402。亞細胞定位預測結果表明，該蛋白很可能是位于質膜上的膜蛋白。

二級結構在線預測結果表明，氨基酸參與形成的α-螺旋（alpha helix）占63.21%，β-折疊（beta sheet）占3.4%，無規則卷曲（random coil）占33.4%。MeNRT2.1蛋白含有MFS蛋白保守結構域，屬于MFS超級家族。通過TMHMM軟件進行預測，依據氨基酸序列預測的NRT2.1拓撲圖（圖5）可以看出，該蛋白具有NRT2家族共有的結構特征，有12個跨膜結構域，屬于NRT2蛋白，并且木薯NRT2.1蛋白氨基酸N-末端和C-末端分別位于細胞膜外和細胞膜內。

2.3 MeNRT2.1蛋白序列比對及進化分析

將MeNRT2.1氨基酸序列與其它植物的NRT2.1進行比較，結果發現MeNRT2.1與苜蓿（Medicago truncatula）、 擬南芥（Arabidopsis thaliana）、可可（Theobroma cacao）、 楊樹（Populus trichocarpa）等物種的NRT2.1的同源性分別為88%、81%、90%、89%。進化樹分析表明，木薯MeNRT2.1氨基酸序列與可可樹TcNRT2.1的親緣關系最近（圖 6）。

2.4 MeNRT2.1在煙草原生質體細胞中的瞬時表達

本研究構建了以GFP為標記的pC1302-MeNRT2.1載體，通過PEG介導的煙草原生質體瞬時表達系統觀察目的基因融合蛋白的亞細胞定位，在激光共聚焦顯微鏡綠色熒光下觀察GFP熒光。如圖7所示，對照（空載體pC1302）的原生質體細胞充滿綠色熒光，而pC1302-MeNRT2.1僅在細胞膜上出現GFP綠色熒光。結果表明該基因編碼的蛋白主要定位于細胞膜上，屬于跨膜轉運蛋白。

2.5 MeNRT2.1在木薯中的表達分析

為了研究在MeNRT2.1在木薯中的表達模式，采用實時熒光定量PCR對不同濃度硝酸鹽下木薯根、莖、葉中基因的表達量進行分析，結果見圖8。由圖8可知，MeNRT2.1在組培苗的根中表達，在莖、葉中幾乎不表達，并且在NO3-濃度為0.2 mmol/L時表達量最高，NO3-濃度為10 mmol/L時其相對表達量較低，無NO3-時幾乎不表達，即該基因具有誘導型組織特異性表達模式。同時，RNA-seq高通量測序結果與本研究qRT-PCR的結果相一致。

3 討論與結論

本研究根據擬南芥中已知的NRT2.1基因，利用同源克隆和RT-PCR技術，獲得木薯中一個高親和硝態氮轉運蛋白基因MeNRT2.1。該基因含有1 593 bp的CDS序列，編碼530個氨基酸。生物信息學分析結果表明，NRT2.1基因核苷酸及氨基酸序列與其他植物NRT2.1有較高的同源性，MeNRT2.1與可可樹[23]、楊樹[24]和苜蓿[25]的同源性分別高達90%、89%和88%，這與聚類分析的結果相一致，表明該基因可能為木薯NRT2.1基因，與其他植物中報道的NRT2.1基因具有相似的功能[11，13-16]。

研究已表明擬南芥AtNRT2.1基因對硝態氮信號反應較快，在低濃度下短時間內表達量可能達到峰值，然后恢復正常水平[26]，并且AtNRT2.1的表達具有階段性，低濃度NO3-處理2、4、10 d時均有最大峰值出現[27]，在木薯中可能具有類似的表達模式。但因木薯長期生長于貧瘠土壤中，本研究將木薯幼苗在不同濃度硝態氮中處理20 d，既保證了苗期植株發育的完整性，又符合木薯生理特征及自然生長環境。通過qRT-PCR、RNA-seq（另文發表）的表達模式分析可知，木薯MeNRT2.1基因能夠被低濃度的硝態氮（0.2 mmol/L NO3-）在根中誘導表達，與已經報道的煙草[14]、大豆[15]、平邑甜茶[28]等植物中的NRT2表達模式相似。MeNRT2.1在低濃度（0.2 mmol/L）的NO3-中相對表達量較高，在10 mmol/L的NO3-中相對表達量較低，可能受到高濃度NO3-的抑制，這與高親和轉運體系NRT2基因功能基本相似。不同環境中基因發揮不同的功能，有利于植物長期適應氮貧瘠環境。

跨膜結構預測顯示該蛋白具有12個跨膜區，符合NRT2家族蛋白共有的跨膜結構特征，原生質體瞬時表達結果表明該蛋白位于質膜上，為膜結構蛋白。有研究結果表明，AtNRT2.1主要定位于擬南芥根皮層和表皮的質膜上[11]，孔敏等[16]也發現BcNRT2 定位于白菜細胞膜上。膜上的蛋白質主要有載體蛋白、通道蛋白、蛋白受體以及與細胞活動有關的離子泵等，說明MeNRT2.1的編碼產物對于細胞質膜的穩定性或控制蛋白轉運具有一定的作用[29]。需進一步優化實驗條件，利用轉基因、蛙卵異源表達系統等技術對有關該基因編碼蛋白親和NO3-的分子機制及編碼蛋白在質膜上發揮的轉運功能進行深入研究。

本研究成功克隆木薯MeNRT2.1基因，并對其序列結構和表達模式進行了初步分析，為深入認識木薯耐低氮和氮素高效利用的理論機制提供了相關依據，也為木薯NO3-吸收轉運積累機制的深入研究提供了理論參考。

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責任編輯：林海妹