香蕉枯萎病菌假定G蛋白偶聯受體基因Fogpr1的功能分析

郭立佳　梁昌聰　劉磊　汪軍　楊臘英　王國芬　黃俊生

摘 要 為了研究尖孢鐮刀菌古巴?；图俣℅蛋白偶聯受體基因fogpr1的功能，構建了fogpr1基因敲除突變體。與野生型相比，fogpr1基因敲除突變體在菌絲生長、產孢量和菌落形態等方面沒有明顯變化，對巴西蕉的致病性也沒有降低。此外，酵母雙雜交實驗結果表明，Fogpr1可以與G蛋白Fga1、Fga2 和Fgb1互作。這些結果表明Fogpr1可能是一個G蛋白偶聯受體，但不參與調控尖孢鐮刀菌的發育和致病性。

關鍵詞 尖孢鐮刀菌古巴?；?；G蛋白；致病性；生長；發育

中圖分類號 S432.4 文獻標識碼 A

Abstract To investigate the functions of the G-protein coupled receptor gene fogpr1 in the pathogenic fungus Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc）， the fogpr1 deletion mutants were constructed. The fogpr1-deletion mutants showed no apparent alterations in mycelium growth， conidiation and colonial morphology as compared to the wild type. The virulence against banana plants（Musa spp. cv. Brazil）was not reduced. Additionally， the protein Fogpr1 could interact with the G-protein Fga1， Fga2 and Fgb1 in yeast two-hybrid system. The results indicate that Fogpr1 might be a G-protein coupled receptor， whereas play no roles in development and pathogenicity of Foc. The results lay a foundation for studying the roles of G-protein coupled receptors in Foc.

Key words Fusarium oxysporum f. sp. cubense； G-protein coupled receptor； Pathogenicity； Growth； Development

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.021

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種無性真菌，廣泛存在于各種環境中，其在土壤中可以長久存活，故也是一種土壤習居菌。其中一些尖孢鐮刀菌是重要的植物病原菌，引起許多作物包括棉花、番茄、西瓜、甘藍、香蕉等根腐病或枯萎病。因此，尖孢鐮刀菌病原菌是許多農作物生產的一種重要限制因子[1-2]。當前重要作物枯萎病的防治主要依靠使用抗性品種，包括使用抗性砧木。抗病育種是該類病害防治的重要研究方向。

尖孢鐮刀菌古巴?；停‵. oxysporum f. sp. cubense）是引起香蕉枯萎病的病原菌。該病原菌引起的香蕉枯萎病十分難以防治，目前尚無十分有效的方法，使用抗病品種是今后防治該病害的主要措施之一。對其致病機理的深入理解將有助于香蕉抗枯萎病育種。近年來，在尖孢鐮刀菌古巴專化型致病機理研究方面取得了一些進展。筆者所在的科研團隊破譯了尖孢鐮刀菌古巴?；?號和4號小種基因組序列[3]。國內外一些學者鑒定了一些致病基因包括fgb1[4]、FoOCH1[5]、Focr4-1562[6]、Foatf1[7]等。然而，這些研究結果相對于復雜的病原菌致病機理來說，仍然十分有限，仍需更深入研究。尤其是尖孢鐮刀菌如何感知環境和宿主，在很大程度上仍是未知。

研究發現，在一些真核生物中，G蛋白偶聯受體（GPCR）是一類包含7個跨膜結構域的蛋白，主要負責傳遞胞外信號到胞內并觸發一些信號傳導級聯。G蛋白偶聯受體在各種信號如光、質子、鈣離子、氣味、氨基酸、核苷酸、蛋白、多肽、激素類和脂肪酸等刺激下，會發生構象變化，導致與其結合的G蛋白復合物解離為α亞基和βγ二聚體，繼而激活下游信號通路，引起生理和代謝的變化[8]。在一些模式真菌中，一些G蛋白偶聯受體已有研究報道。在芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，STE3和STE2參與有性結合，Gpr1參與營養感知，調控假菌絲的分化[8]。Gehrke A等[9]研究發現GprC和GprD參與調控煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的菌落生長、菌絲形態發生和毒力；Xue C等[10]發現在新隱球菌（Cryptococcus neoformans）中 Gpr4感知氨基酸可激活依賴cAMP的蛋白激酶A途徑；Li L等[11]發現在粗糙鏈孢霉（Neurospora crassa）中GPR-4對碳源依賴的無性生長和發育是必需的；Miwa T等[12]發現Gpr1調控白色念球菌（Candida albicans）的形態發生和菌絲形成；Han K等[13]發現GprD負調控構巢曲霉（A. nidulans）的有性發育。這些研究結果表明，G蛋白偶聯受體在真菌生長、形態發生和毒力等生物過程中具有重要調控作用。在尖孢鐮刀菌中，一些學者發現G蛋白基因（fga1、fga2和fgb1）參與尖孢鐮刀菌黃瓜專化型（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）的發育和致病性，并可能參與胞外信號在胞內的傳遞。但是，迄今與G蛋白復合物結合的G蛋白偶聯受體仍未有所研究報道。

筆者采用生物信息學方法從尖孢鐮刀菌古巴?；突蚪M序列中鑒定了假定G蛋白偶聯受體編碼基因Fogpr1，發現其編碼蛋白與芽殖酵母G蛋白偶聯受體Gpr1、煙曲霉GprC和GprD等在發育關系上較為接近，相似性較高。為驗證其功能，筆者進一步通過基因敲除實驗獲得Fogpr1敲除突變體，并對突變體進行了分析，以期了解其功能及在尖孢鐮刀菌古巴?；颓秩鞠憬哆^程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）培養基PDA、PDB和再生培養基的配制參照文獻[4]的方法進行。

（2）0.7 mol/L氯化鈉溶液，Driselase崩潰酶溶液（20 mg/mL， Sigma）轉化使用的STC溶液和PTC溶液的配制方法參考文獻[4]。

（3）供試菌株和質粒尖孢鐮刀菌古巴專化型（F. oxysporum f. sp. cubense）4號小種菌株B2和pCT74質粒由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所微生物資源研究利用課題組保存。

（4）供試香蕉品種巴西蕉苗（Musa sp. AAA. cv. Brazil）由中國熱帶農業科學院組織培養中心提供，株高大約20 cm。

1.2 方法

（1）真菌基因組DNA提取野生型菌株B2和轉化菌株的菌絲體培養及基因組DNA提取參照文獻[14]的方法。

（2）fogpr1基因敲除載體的構建以野生型菌株基因組DNA為模板，用引物對AF（5′-ggggtaccATG

TCAGCAACAGAAGGAAGATG-3′， 劃線堿基為KpnⅠ識別序列）和AR（5′-ccgctcgagACAGTAACGGCGGT

CAATCC-3′，劃線堿基為XhoⅠ識別序列）進行PCR擴增，獲得fogpr1基因開放閱讀框上游5′端745 bp同源臂DNA；用引物對BF（5′-tcccccgggTG

TTCCACTCACCAATCTCCTT-3′，劃線堿基為SmaⅠ識別序列）和BR（5′-tgctctagaCTGCTCTGCTGTTGTT

GACTAA-3′，劃線堿基為XbaⅠ識別序列）進行PCR擴增，獲得下游3′端826 bp同源臂DNA。PCR擴增采用Premix TaqTM試劑（TaKaRa， Dalian），擴增條件為：95 ℃預變性5 min，然后進行35個擴增循環，即95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃保溫5 min。所擴增的DNA片斷分別連接于pMD19T載體，形成pMD19T-5A和pMD19T-3B克隆載體。再用限制性內切酶KpnⅠ和XhoⅠ、SmaⅠ和XbaⅠ從克隆載體切下5′端和3′端同源臂DNA，分別連接于相同限制性內切酶酶切的線性pCT74載體（包含潮霉素抗性基因hph和GFP基因表達盒）中，構建成pCT74-fogpr1載體。最后用KpnⅠ和XbaⅠ從pCT74-fogpr1載體中切下用于轉化的DNA片斷，回收純化備用。

（3）尖孢鐮刀菌古巴?；驮|體制備參照文獻[4]的方法進行。

（4）PEG介導的原生質體轉化參照文獻[4]的方法進行。

（5）PCR擴增鑒定fogpr1基因敲除突變體以fogpr1轉化子和野生型菌株B2基因組DNA為模板，采用引物F1（5′-GTGTTGGAGGTGATTATGAG-3′）和F2（5′-CGTTGCAAGACCTGCCTGAA-3′）進行PCR擴增，檢測轉化子是否在fogpr1 5′端發生的同源重組；用引物C1（5′-ATGAACTCGCAAGGCAACAG-3′）和C2（5′-TCATTTTCCTCTCGGTGTACG-3′）進行PCR擴增，檢測轉化子是否存在fogpr1基因，預計分別擴增約2 180 bp和1 606 bp DNA片斷。如果用F1和F2引物進行PCR擴增結果為陽性而用C1和C2 引物進行PCR擴增結果為陰性，那么這類轉化子即為fogpr1基因敲除突變體。PCR擴增采用Premix TaqTM試劑（Takara，Dalian），擴增條件與1.2-（2）所述相同，除延伸時間改為2 min外。

（6）酵母雙雜載體的構建及酵母轉化分別用引物對Fogpr1_A（5′-ggaggccagtgaattcAAGCTTACGAC

ATGGAGCTTG-3′和5′-cgagctcgatggatccTTGATTCGG

TCGTCGAGGGGC-3′，小寫字母堿基為同源重組序列，下同）和引物對Fogpr1_B（5′-ggaggccagtgaattcCG

AAACACCATCGTCTTCGCC-3′和5′-cgagctcgatggatcc

TCTATGCGCATCCATGCTCCT-3′），以基因組DNA為模板，進行PCR擴增，可獲得Fogpr1胞內肽段A（第48～109氨基酸殘基）和B（第344～479氨基酸殘基）DNA編碼序列，分別為186 bp和408 bp。采用clonase酶（Clontech， USA）通過重組反應，分別連接于捕獲載體pGADT7 AD，形成載體pGADT7-A和-B。分別用引物對T7-fga1（5′-catggaggccgaattcAT

GGGCTGCGGAATGAGCACAGAG-3′和5′-gcaggtcga

cggatccTTAGATAAGACCACAGAGACGCAG-3′）、T7-

fga2（5′-catggaggccgaattcATGGGCGCATGCATGAGC

TCGAGT-3′和5′-gcaggtcgacggatccTCAAAGAATGCC

CGAGTCCTTAAG-3′）和T7-Fgb1（5′-catggaggccgaat

tcATGAACTCGCAAGGCAACAGT-3′和5′-gcaggtcga

cggatccTCATTTTCCTCTCGGTGTACG-3′），以cDNA為模板，進行PCR擴增，獲得G蛋白α和β亞基編碼基因fga1、fga2和fgb1序列，并分別連接于誘餌載體pGBKT7中，形成載體pGBKT7-fga1、-fga2和-fgb1。隨后將所構建捕獲載體和誘餌載體送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。驗證克隆序列正確后，將捕獲載體和誘餌載體進行兩兩組合，共轉化酵母菌株Y2H Gold。酵母轉化參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System試劑盒（Clontech， USA）所示的說明書方法進行。在QDO培養基上篩選陽性克隆。同時，共轉化空載的捕獲載體和誘餌載體的酵母Y2H Gold菌株做對照。

（7）致病性測定及病情統計將fogpr1敲除突變體和野生型菌株B2菌株分別接種于300 mL的PDB培養基中，置于25 ℃、180 r/min的搖床中震蕩培養7 d。離心收集分生孢子，用蒸餾水重懸，將分生孢子懸浮液濃度調至106個/mL。野生型菌株與fogpr1敲除突變體均處理30株幼苗，每株苗澆50 mL孢子懸浮液，以無菌水作為對照。實驗重復3次。處理后，按照常規方法栽培管理，并觀察植株的發病情況。接種處理30 d后，從中間縱向切開球莖，觀察球莖褐變程度以及葉片黃化情況，記錄每株幼苗發病級數，病害分級詳見文獻[14]： 0級健康無發??；1級20%以內球莖組織褐變；2級40%以內球莖褐變；3級為60%以內球莖褐變；4級為80%以內球莖褐變，葉片黃化；5級為80%以上球莖褐變，植株死亡。

1.3 數據處理

接種fogpr1突變體和野生型菌株B2的香蕉幼苗發病情況用病情指數表示，病情指數計算采用公式：病情指數=100×[∑（植株發病級數×對應株數）/（植株發病最高級數×總株數）]。數據采用SigmaPlot 12.5軟件統計分析模塊進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 fogpr1基因敲除載體的構建與突變體鑒定

用限制性內切酶KpnⅠ和XhoⅠ酶切fogpr1基因敲除載體pCT74-fogpr1，結果可切下預計的約750 bp DNA條帶，用SmaⅠ和XbaⅠ酶切，可切下約840 bp DNA條帶（圖1-A）。測序結果表明所克隆的DNA序列正確。這些結果表明fogpr1基因敲除載體已構建成功。以其中4個轉化子和野生型菌株基因組DNA為模板，用F1/F2引物對進行PCR擴增，結果顯示，以轉化子A1～A4基因組DNA為模板，可擴增到大約2.1 kb的DNA擴增條帶，野生型及清水對照均無PCR擴增條帶（圖1-B）；用C1/C2引物對進行PCR擴增，結果顯示，以轉化子A1～A4的DNA和清水為模板，PCR擴增檢測均無條帶，而以野生型菌株B2的DNA為模板，可檢測到1.4 kb左右的DNA擴增條帶（圖1-C）。這些結果表明轉化子A1～A4均為fogpr1敲除突變體。

2.2 fogpr1基因敲除突變體表型分析

在PDA平板上培養36 h，fogpr1敲除突變體菌株（A1～A3）與野生型菌株B2形成的菌落形態相似（圖2-A）；菌絲均呈輻射狀向四周生長，沒有明顯差異（圖2-B）。在PDA平板上培養4 d，野生型菌落平均直徑（4.62 cm）與突變體菌株A1和A2菌落平均直徑相當（4.61 cm和4.48 cm，圖2-C）。在PDA平板上培養7 d，A1和A2突變體菌株產孢量（20.1×106個和19.5×106個，圖2-D）與野生型菌株B2產孢量（20.0×106個）相當。結果表明，敲除fogpr1基因沒有導致尖孢鐮刀菌的表型發生明顯變化。

2.3 fogpr1基因敲除突變體對巴西蕉的致病性

致病性測定結果顯示，接種fogpr1敲除突變體菌株A1和A2的巴西蕉植株平均病情指數（43.3和41.9，圖3）與野生型菌株B2的平均病情指數（45.2，圖3）相當，而對照沒有發病。該結果表明敲除fogpr1基因不影響其對巴西蕉的致病性。

2.4 Fogpr1與G蛋白的互作分析

利用酵母雙雜系統分析Fogpr1蛋白與G蛋白的互作，結果顯示，所有共轉化誘餌載體和捕獲載體的酵母菌株在DDO+X-α-Gal的平板上可正常生長；而在QDO+AbA抗性平板上，共轉化pGADT7-53和pGADT7-T的正對照菌株菌落生長正常，可水解X-α-Gal產生藍色底物，但共轉化pGADT7-lam和pGADT7-T的負對照菌落不能生長，呈暗灰色，無藍色底物產生（圖4-A）；同時，共轉化pGADT7-Fogpr1-A與pGBKT7-Fga1、-Fga2和-Fgb1的酵母菌株可以正常生長，菌落呈白色，可產生藍色底物（圖4-B）；再者，共轉化pGADT7-Fogpr1-B與pGBKT7-Fga1、-Fga2和- Fgb1的酵母菌株可以正常生長，菌落呈白色，可產生藍色底物（圖4-C）。這些表明，Fogpr1蛋白胞內肽段A和B與Fga1和Fgb1在酵母雙雜系統中存在互作，且與Fga2的互作最為明顯。

3 討論與結論

筆者用TMHMM軟件預測Fogpr1蛋白的跨膜結構，結果表明尖孢鐮刀菌Fogpr1蛋白具有典型G蛋白偶聯受體的結構特征，包括7個跨膜區、4個胞外區和4個胞內區，暗示fogpr1可能是一個G蛋白偶聯受體基因?；诘鞍装被嵝蛄械木垲惙治霰砻鱂ogpr1與已知功能的煙曲霉G蛋白偶聯受體GprC和GprD[9]在進化關系上較為接近。為了分析fogpr1基因的功能，筆者構建了fogpr1基因敲除突變體，并分析該突變體的表型，發現其在菌落形態、菌絲生長、產孢能力和致病力等方面均沒有發生明顯的變化，表明fogpr1基因可能不參與調控尖孢鐮刀菌生長、發育和致病力。該結果與Gehrke A等[9]報道的煙曲霉（A. fumigatus）假定G蛋白偶聯受體GprC和GprD的功能明顯不同。Gehrke A等研究發現敲除GprC和GprD導致突變體生長嚴重減緩，萌發率降低，在小鼠侵染模型中其致病力顯著下降，而且基因互補可以恢復為初始野生型表型[9]。這表明雖然Fogpr1與GprC和GprD在進化關系上較為接近，但其在功能上并沒有相似性。再者，由于Fogpr1不具有Fga1[15]、Fga2[16]和Fgb1[17-18]蛋白的功能如調控尖孢鐮刀菌的菌絲分枝、細胞極性生長和致病力等，因此，推測Fogpr1可能與G蛋白不在一個信號傳導途徑上。

通過酵母雙雜系統分析其與G蛋白Fga1、Fga2和Fgb1的互作，筆者發現其胞內區A和B均可以與G蛋白Fga1、Fga2和Fgb1的互作，表明Fogpr1可能是一個G蛋白互作的蛋白。由于煙曲霉GprC和GprD是否與G蛋白互作并無研究報道，因此無法得知。在新型隱球菌（C. neoformans）中，Xue C等[10]研究發現Gpr4可以與G蛋白α亞基Gpa1互作。Miwa A等[12]研究發現白色念球菌（C. albicans）的Gpr1的羧基端肽段可與G蛋白α亞基 Gpa2互作。這表明Fogpr1與新型隱球菌Gpr4和白色念球菌Gpr1相似，可以和G蛋白互作。因此Fogpr1可能是一個G蛋白偶聯受體。

綜上所述，根據fogpr1突變體的表型分析和酵母雙雜實驗結果，筆者推測Fogpr1可能是一個G蛋白偶聯受體，但其并不參與調控尖孢鐮刀菌的發育和致病性。至于該蛋白在尖孢鐮刀菌古巴?；椭惺欠窬哂衅渌δ苡写M一步研究。該研究為進一步鑒定G蛋白偶聯受體奠定了基礎。

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責任編輯：沈德發