路易斯安那鳶尾LiNramp2基因克隆與定量表達分析

田松青　朱旭東　趙沿海　顧春筍　黃蘇珍

摘 要 利用RACE技術克隆了路易斯安那鳶尾LiNramp2基因全長cDNA序列，其大小為1 786 bp，預測編碼519個氨基酸，蛋白質具有11次跨膜結構域，與其他Nramp蛋白同源性達80%以上，說明LiNramp2同其他同源基因保守性很高。定量表達結果顯示，LiNramp2在路易斯安那鳶尾葉片和雄蕊中表達量較高，在雌蕊中表達量最低，根和莖表達量差別不大。隨著鉛處理時間增加，LiNramp2基因在根系表現緩慢下降，在葉片中表現先升高后下降的趨勢，但差異不顯著。

關鍵詞 路易斯安那鳶尾；Pb脅迫；LiNramp2；生物信息學分析；實時熒光定量PCR

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Abstract Louisiana iris is a kind of high ornamental value of perennial plants， found to be tolerance and accumulation of heavy metal Pb. However， research on the molecular tolerance mechanism of Pb was limited. Nramp membrane proteins transport many kinds of metal ions. The intermediate fragment of LiNramp2 was obtained by analyzing the Louisiana iris transcriptome. The LiNramp2 gene was cloned by using RACE technology and its length was 1 786 bp， encoding 519 aa. The protein LiNramp2 was with 11 transmembrane domains， and the conservative analysis found that there were more than 80% similar sites with others of the same source Nramps， showing LiNramp2 was highly conservative with other homologous genes. LiNramp2 expressed more in leaf and rhizome and the lowest in pistil， and the expressions in root and rhizome were not significantly different. The gene expression of LiNramp2 in the root decreased slowly as Pb treatment time increased， in the leaf， increased first and then decreased without significance. This study will be beneficial to further studies of the relationship between LiNramp2 and Pb tolerance of Louisiana iris.

Key words Louisiana iris； Pb stress； LiNramp2； Bioinformatics analysis； RT-PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.024

Nramp蛋白家族（Natural resistance associated macrophage proteins）是廣泛存在細菌、真菌和動植物中的一個高度保守的膜蛋白家族，參與如Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Cd2+、Ni2+和Co2+等多種金屬離子運輸[1]。Nramp蛋白最初在哺乳動物中發現，造成巨噬細胞的特異蛋白變異，增加了對細胞內細菌病原菌的敏感性，而命名為天然抵抗力相關的巨噬細胞蛋白[2-3]。在酵母中發現的3個Nramp蛋白SMF1～3，具有調節Mn、Cu、Co、Cd、Fe吸收的功能[4-6]。植物中首先發現水稻（Oryza sativa）的3個OsNramps1～3蛋白[3，7]，在擬南芥中純化得到了6種Nramp1～6蛋白[8-9]。植物Nramp蛋白可分成2個亞族：AtNramp1和AtNramp6為一個亞族，AtNramp2～5為另一個亞族[10-11]，水稻的OsNramp1和OsNramp3為第一亞族，OsNramp2為第二亞族。植物Nramp蛋白推測有11或12個跨膜結構域（TMs），并在TM-8和TM-9之間存在一個特有的“共有運輸基序”，也是高度進化保守的[9，12]，在根和地上部分都表達，在質膜或液泡膜上轉運金屬離子[13]。大多數Nramp 轉運蛋白有運輸必需元素的能力，如鐵（Fe）、錳（Mn），也能運輸如鎘（Cd）的有毒重金屬。在植物中，這個特性最初報道的是AtNrampP3/4轉運蛋白[14]。AtNramp3/4具有從液泡存儲中再利用Fe和Mn的生理作用，AtNramp3在擬南芥維管束中表達，可能與金屬長距離運輸有關，其功能的缺失也導致Cd超敏反應[15-18]。AtNramp1是一種高親和性錳的吸收轉運蛋白。AtNramp6基因存在于一個不同于液泡和線粒體的泡狀內膜而對鎘敏感，AtNramp6的無效等位基因更耐鎘[19]。Wei等[20]的試驗結果表明，超富集植物遏藍菜（Thlaspi caerulescens）同類基因TcNramp3/4 可將Cd轉運至酵母細胞內，對Ni則相反，TcNrmap3能將Ni外排至酵母細胞外而提高轉化子耐性；轉基因煙草亞細胞定位分析發現TcNRrmap3/4基因均定位在質膜上。TcNrmap3能轉運Fe、Mn、Cd，不能轉運Zn，TcNrmap4則能運輸4種金屬，2個基因均定位在液泡膜上，而蛋白功能上與AtNrmap3/4沒有區別[21]。大麥（Hordeum vulgare）在充足氮供應且Cd存在時Nramp轉錄下調，但當缺少氮時強烈上調[22]。Ni超富集植物Thlaspi japonicum的TjNramp3基因專一轉運Ni，但是不轉運Zn、Cd和Mn[23]。最近，有研究結果表明，OsNamp1參與對Cd的吸收和在葉中的積累[24-25]，OsNamp5轉運蛋白是水稻吸收Mn的基礎，也是Cd吸收的主要途徑[26-28]。總之，不同的Nramp家族起的作用不同，目前關于Nramp基因家族在高等植物中的功能和其與金屬離子吸收的關系尚不明確，還有待于進一步的研究。

路易斯安那鳶尾（Louisiana iris）為鳶尾科鳶尾屬（Iris L.）路易斯安那鳶尾系（Iris ser. Hexagonae）的一類觀賞濕生植物，原產于美國墨西哥灣沿岸沼澤。朱旭東等[29]研究結果表明，低濃度Pb脅迫下路易斯安那鳶尾可通過自身的抗氧化系統緩解Pb脅迫對機體的毒害作用，從而保證植株的生長和發育，具有一定的吸收和忍耐重金屬Pb的能力。該基因在重金屬鉛毒性等中的研究較少，路易斯安那鳶尾Nramp基因目前尚未見報道。本研究利用轉錄組序列分析與RACE克隆基因的方法，以路易斯安那鳶尾品種‘Professor Neil的cDNA為模板，克隆Nramp基因家族中的1個同源基因，命名為LiNramp2。同時通過實時熒光定量PCR的方法測定和分析路易斯安那鳶尾不同組織和不同時間鉛處理時的LiNramp2基因表達量，從而對路易斯安那鳶尾富集鉛的生長、結構[29]和生理生化[30]特性進一步驗證，為進一步分析LiNramp2基因的分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

基因克隆、組織器官特異性和響應Pb脅迫的表達特性定量分析所用試驗材料均為路易斯安那鳶尾（Louisiana iris）主栽品種‘Professor Neil。基因克隆和響應Pb脅迫的表達特性定量分析試驗選取在秋季分蘗旺盛時期生長健壯、長勢良好的分株苗。組織特異性定量分析試驗選用春季盛花期花朵正開的包括花、葉、根狀莖和根的完整植株。

1.2 方法

1.2.1 路易斯安那鳶尾LiNramp2基因克隆 （1）提取總 RNA 和合成cDNA。試驗于2013年9月在南京中山植物園溫室進行。將路易斯安那鳶尾分株苗用1/2 Hoagland 營養液水培預培養30 d后，采集新鮮葉片和根系。利用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑提取新鮮葉片和根系總RNA。通過紫外分光光度計測定OD260/OD280，鑒定總RNA質量。總RNA的第一鏈cDNA采用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑盒（TaKaRa，日本，具體見說明書）合成。

（2）LiNramp2基因中間片段克隆。從路易斯安那鳶尾轉錄組數據中篩選出LiNramp2基因相關序列片段信息（comp160718_c0_seq1）。利用Primer 5和Oligo 7軟件根據轉錄組中的信息設計中間片段引物（表1），利用已合成的cDNA經PCR反應擴增LiNramp2基因中間片段，PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，32個循環；72 ℃ 10 min。將PCR擴增得到LiNramp2基因的中間片段進行電泳切膠回收，然后連接到T載體上，轉化后篩選陽性克隆進行測序。

（3）LiNramp2基因3′端序列克隆。利用 Primer 5和Oligo 7軟件，根據測序獲得的LiNramp2基因中間片段設計3′端特異PCR引物（表1）。采用Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得LiNramp2基因的3′端序列。

（4）LiNramp2基因5′端序列克隆。利用 Primer 5和Oligo 7軟件，根據測序獲得的中間序列設計 5′端正向PCR引物和反向特異PCR引物（表1）。采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends， Version 2.0試劑盒獲得LiNramp2基因的5′端序列。

（5）序列拼接。采用DNAMAN軟件對克隆得到的5′端序列、3′端序列和中間序列進行首尾拼接，得到LiNramp2基因的全序列。

1.2.2 路易斯安那鳶尾LiNramp家族基因編碼蛋白和生物信息學分析 使用Oligo 7軟件分析LiNramp2基因編碼的氨基酸序列。從NCBI數據庫中篩選LiNramp2的同源氨基酸序列，通過 AlignX軟件分析LiNramp2基因編碼的氨基酸序列的保守性，并基于此基因編碼的氨基酸序列，利用MEGA 6軟件中的泊松分布模式構建同源氨基酸序列的系統樹，分析同源氨基酸序列的進化關系。采用SOPMA軟件在線分析LiNramp2基因編碼的蛋白質的二級結構，并通過TMHMM 2.0軟件在線分析該蛋白質的跨膜結構域。LiNramp2蛋白保守結構域的查找通過http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast完成。蛋白質三維結構預測在http：//swissmodel.expasy.org上進行，并通過http：//www.ebi.ac.uk/InterProScan尋找該類蛋白在不同物種中的分布。

1.2.3 路易斯安那鳶尾LiNramp2基因在不同組織以及響應Pb脅迫的表達特性分析 （1）樣品制備。開花季節對路易斯安那鳶尾成年植株的根、莖、葉和花等組織各取樣3份，用于LiNramp2基因組織特異性表達分析試驗。對分株苗進行0、1、3、6、12、24 h不同時間長度的鉛（200 mg/L）脅迫，采集脅迫的根和葉組織各3份，用于LiNramp2基因響應Pb脅迫的表達特性分析試驗。采集的樣品用無菌水清洗后用錫箔紙包好，立即放入超低溫冰箱保存備用。使用TaKaRa試劑盒提取樣品總RNA，并將RNA反轉錄成cDNA，用于實時熒光定量PCR分析。（2）實時熒光定量PCR。根據已克隆的基因序列用Premier 5.0軟件設計特異性檢測引物（表2）。實時熒光定量PCR采用SYBR GREEN染料法，以UBC為內參基因，做相對定量檢測。將上述提取備用樣品的cDNA置于定量PCR儀LightCycler3（Roche 公司）中，設定熒光采集通道以及讀取熒光步驟。其PCR反應程序為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45個循環；72 ℃單點檢測信號。結束后最后加入溶解曲線程序：95 ℃ 0 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s，連續檢測信號。根據數據分析得到各個樣品的CT值，假定擴增效率為100%，并假定標準曲線及每次擴增之間的效率保持一致，相對轉錄水平采用2-△△CT的方法進行計算。

1.3 數據分析

采用Excel和SPSS軟件對試驗數據進行統計和方差分析。所有數據均為3次重復的平均值。數據用鄧肯多重比較進行顯著差異性測定。

2 結果與分析

2.1 LiNramp2基因全長及生物學信息分析

2.1.1 基因全長及編碼蛋白質 由設計的引物通過PCR擴增到LiNramp2基因的中間片段，長度為1 064 bp（圖1-A）。根據獲得的中間片段序列，設計特異引物，進行3′RACE擴增得到長度為352 bp的序列（圖1-B）；5′RACE擴增得到長度為676 bp的序列（圖1-C）。將擴增到的LiNramp2中間片段、3′端序列和5′端序列用DNAMAN軟件進行拼接，得到LiNramp2基因的完整序列（圖2），總長度為1 786 bp，開放閱讀框（ORF）為1 557 bp，5′非編碼區30 bp，3′非編碼區199 bp，預測編碼蛋白質含519個氨基酸。

2.1.2 LiNramp2蛋白質二級結構及跨膜結構 通過SOPMA軟件在線分析，LiNramp2基因推導的蛋白質LiNramp2中α螺旋（α-Helix）占46.63%，延伸鏈（Extend strand）占23.51%，不規則螺旋（Random coil）占21.39%（圖3），α-螺旋是LiNramp2最主要的二級結構。TMHMM軟件在線分析LiNramp2蛋白質具有11次跨膜結構，這與跨膜蛋白特征相符合（圖4）。

2.1.3 LiNramp2蛋白質保守性及進化樹分析 通過NCBI數據庫中直接搜索LiNramp2氨基酸序列與利用LiNramp2氨基酸序列blastp的方法，從數據庫中篩選出10種同源氨基酸序列：擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa Japonica Group）、Solanum lycopersicum、蕓苔（Brassica rapa）、桑樹（Morus notabilis）、海棗（Phoenix dactylifera）、狗尾草（Setaria italica）、短柄草（Brachypodium distachyon）、短藥野生稻（Oryza brachyantha）和梅（Prunus mume）。利用Clustalw軟件分析LiNramp2和這10種同源氨基酸序列，其相似位點占85.8%（圖5中彩色部分），相同位點占48.0%（圖5中黃色部分），說明LiNramp2同源氨基酸間有較高的保守性。

利用MEGA6分析這11種同源氨基酸序列進化關系（圖6），反應了同科間的LiNramp2關系較近，如禾本科（水稻、狗尾草、短柄草、短藥野生稻）與十字花科（擬南芥和蕓苔）植物。路易斯安那鳶尾LiNramp2與海棗關系最近，再與單子葉植物綱禾本科關系較近，與其他植物關系較遠。

2.2 路易斯安那鳶尾LiNramp2在不同組織的表達特性分析

如圖7所示，路易斯安那鳶尾基因LiNramp2在不同組織表達量大小順序為：雄蕊>葉>外花瓣>內花瓣>根>根狀莖>雌蕊，其中雄蕊最高，雌蕊最低。總體上LiNramp2在路易斯安那葉片和雄蕊中表達較高，一直在雌蕊中表達最低，根和根狀莖中表達量差別不大，根中稍高于根狀莖中。

2.3 路易斯安那鳶尾LiNramp2響應Pb脅迫的表達特性分析

不同LiNramp2基因在路易斯安那鳶尾根系和葉片兩組織中的轉錄水平不一樣，在根系中表達普遍比在葉片中表達高（圖8）。隨著鉛處理時間增加，LiNramp2基因在根系表現緩慢下降，在葉片中表現出先升高后下降的趨勢，總體上沒有顯著差異（p>0.5）。

3 討論與結論

植物基本礦質營養吸收與有毒重金屬的積累密切相關。通常，有毒重金屬進入并分布到植物體內，是通過從環境吸收礦質必需元素的途徑來實現的[28]。重金屬的毒性原因往往也是礦質必需元素和有毒金屬之間競爭產生的。轉運蛋白不僅在植物體內礦質必需元素運輸過程中發揮重要作用，而且可轉運重金屬，同時也參與金屬穩態的調控。雖然最近已鑒定出很多重金屬轉運蛋白家族，但只是集中在少數的植物和幾種重金屬中，且不同蛋白轉運金屬離子的類型以及在細胞、組織中的定位都不是很清楚。為了進一步解讀植物重金屬積累能力和對有毒重金屬抗性發生機理及機制，本文成功克隆了重金屬轉運蛋白家族LiNramp2基因，并對其表達部位和對鉛脅迫所表達特性進行了探討。

對于水稻和擬南芥等已完成DNA基因組測序的模式植物或重要作物等來說，可以直接設計特異性引物來克隆所需要的基因。而對于缺乏DNA基因組測序的路易斯安那鳶尾來說，對照轉錄組所得到的序列，采用RACE方法可以對所需要的基因進行同源克隆。根據這一方法本文從路易斯安那鳶尾品種‘Professor Neil中克隆了LiNrmap基因家族中的這一同源基因。克隆的LiNramp2基因全長為1 786 bp，預測編碼蛋白質含519個氨基酸。質膜或液泡膜上轉運蛋白Nramp參與重金屬脅迫的防御機制[28]，這些蛋白的N端通常包含多個跨膜結構域。本研究采用TMHMM軟件工具對克隆的基因進行跨膜結構域分析顯示，LiNramp2蛋白的N-末端具有11個跨膜結構域，與其他物種Nramp蛋白相一致[9，12]。

路易斯安那鳶尾響應鉛脅迫的表達特性分析表明，LiNramp2對鉛脅迫不敏感，在鉛處理后的24 h時，轉錄水平有較少提高，而且在葉中表達比根中高。這與OsNamp1參與對Cd的吸收和在葉中的積累相一致[24-25]，可能與葉中積累鉛有關。對比兩者試驗結果，初步預測該基因確實編碼跨膜運輸蛋白，可能在根向莖運輸重金屬鉛中發揮著重要的作用。

當然植物如何適應重金屬的脅迫是一個非常復雜的過程，Nramp轉運蛋白家族在鉛吸收、去毒化和轉運等方面研究幾乎是空白，本次研究只能初步探討，下一步將進一步研究在更長的脅迫時間、野外條件、亞細胞定位和轉基因功能驗證等方面，同時也可根據本次試驗經驗克隆同家族基因，為進一步研究本家族基因與植物鉛吸收、去毒化和轉運的關系提供參考。

參考文獻

[1] Nevo Y， Nelson N. The NRAMP family of metal-ion transporters[J]. BBA-Mol Cell Res， 2006， 1 763（7）： 609-620.

[2] Vidal S M， Malo D， Vogan K， et al. Natural resistance to infection with intracellular parasites-isolation of a candidate for Bcg[J]. Cell， 1993， 73（3）： 469-485.

[3] Belouchi A， Cellier M， Kwan T， et al. The macrophage-specific membrane protein Nramp controlling natural resistance to infections in mice has homologues expressed in the root system of plants[J]. Plant Mol Biol， 1995， 29（6）： 1 181-1 196.

[4] Supek F， Supekova L， Nelson H， et al. A yeast manganese transporter related to the macrophage protein involved in conferring resistance to mycobacteria[J]. P Natl Acad Sci USA， 1996， 93（10）： 5 105-5 110.

[5] Liu X F， Supek F， Nelson N， et al. Negative control of heavy metal uptake by the Saccharomyces cerevisiae BSD2 gene[J]. J Biol Chem， 1997， 272（18）： 11 763-11 769.

[6] Chen X Z， Peng J B， Cohen A， et al. Yeast SMF1 mediates H+-coupled iron uptake with concomitant uncoupled cation currents[J]. J Biol Chem， 1999， 274（49）： 35 089-35 094.

[7] Belouchi A， Kwan T， Gros P. Cloning and characterization of the OsNramp family from Oryza sativa， a new family of membrane proteins possibly implicated in transport metal ions[J]. Plant Mol Biol， 1997， 33（6）： 1 085-1 092.

[8] Maser P， Thomine S， Schroeder J I， et al. Phylogenetic relationships within cation transporter families of Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2001， 126（4）： 1 646-1 667.

[9] Williams L E， Pittman J K， Hall J L. Emerging mechanisms for heavy metal transport in plants[J]. BBA-Biomembranes， 2000， 1 465（1-2）： 104-126.

[10] Guerinot M L. The ZIP family of metal transporters[J]. BBA-Biomembranes， 2000（1/2）， 1 465： 190-198.

[11] Connolly E L， Fett J P， Guerinot M L. Expression of the IRT1 metal transporter is controlled by metals at the levels of transcript and protein accumulation[J]. Plant Cell， 2002， 14（6）： 1 347-1 357.

[12] Curie C， Alonso J M， Le J M， et al. Involvement of NRAMP1 from Arabidopsis thaliana in iron transport[J]. Biochem J， 2000， 347（3）： 749-755.

[13] Kramer U， Talke I N， Hanikenne M. Transition metal transport[J]. FEBS Lett， 2007， 581（12）： 2 263-2 272.

[14] Thomine S， Wang R C， Ward J M， et al. Cadmium and iron transport by members of a plant transporter gene family in Arabidopsis with homology to Nramp genes[J]. P Natl Acad Sci USA， 2000， 97（9）： 4 991-4 996.

[15] Thomine S， Lelievre F， Debarbieux E， et al. AtNRAMP3， a multispecific vacuolar metal transporter involved in plant responses to iron deficiency[J]. Plant J， 2003， 34（5）： 685-695.

[16] Lanquar V， Lelievre F， Bolte S， et al. Mobilization of vacuolar iron by AtNRAMP3 and AtNRAMP4 is essential for seed germination on low iron[J]. Embo J， 2005， 24（23）： 4 041-4 051.

[17] Lanquar V， Ramos M S， Lelievre F， et al. Export of vacuolar manganese by AtNRAMP3 and AtNRAMP4 is required for optimal photosynthesis and growth under manganese deficiency[J]. Plant Physiol， 2010， 152（4）： 1 986-1 999.

[18] Molins H， Michelet L， Lanquar V， et al. Mutants impaired in vacuolar metal mobilization identify chloroplasts as a target for cadmium hypersensitivity in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell Environ， 2013， 36（4）： 804-817.

[19] Cailliatte R， Lapeyre B， Briat J F， et al. The NRAMP6 metal transporter contributes to cadmium toxicity[J]. Biochem J， 2009， 422： 217-228.

[20] Wei W， Chai T Y， Zhang Yu X， et al. The Thlaspi caerulescens Nramp homologue TcNramp3 is capable of divalent cation transport[J]. Mol Biotechnol， 2009， 41（1）： 15-21.

[21] Oomen R J， Wu J， Lelievre F， et al. Functional characterization of NRAMP3 and NRAMP4 from the metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens[J]. New Phytol， 2009， 181（3）： 637-650.

[22] Finkemeier I， Kluge C， Metwally A， et al. Alterations in Cd-induced gene expression under nitrogen deficiency in Hordeum vulgare[J]. Plant Cell Environ， 2003， 26（6）： 821-833.

[23] Mizuno T， Usui K， Horie K， et al. Cloning of three ZIP/Nramp transporter genes from a Ni hyperaccumulator plant Thlaspi japonicum and their Ni2+-transport abilities[J]. Plant Physiol Bioch， 2005， 43（8）： 793-801.

[24] Uraguchi S， Fujiwara T. Cadmium transport and tolerance in rice： perspectives for reducing grain cadmium accumulation[J]. Rice， 2012， 5（5）： 1-8.

[25] Takahashi R， Ishimaru Y， Senoura T， et al. The OsNRAMP1 iron transporter is involved in Cd accumulation in rice[J]. J Exp Bot， 2011， 62（14）： 4 843-4 850.

[26] Sasaki A， Yamaji N， Yokosho K， et al. Nramp5 is a major transporter responsible for manganese and cadmium uptake in rice[J]. Plant Cell， 2012， 24（5）： 2 155-2 167.

[27] Ishimaru Y， Takahashi R， Bashir K， et al. Characterizing the role of rice NRAMP5 in manganese， iron and cadmium transport[J]. Sci Rep， 2012， 2： 286.

[28] Clemens S， Aarts M G， Thomine S， et al. Plant science： the key to preventing slow cadmium poisoning[J]. Trends Plant Sci， 2013， 18（2）： 92-99.

[29] Zhu X D， Tian S Q， Huang S Z， et al. Effects of Pb on the growth and subcellular structure of Louisiana iris， and its localization in the plant[J]. Fresen Environ Bull， 2014， 23（10）： 2 395-2 400.

[30] 朱旭東， 原海燕， 黃蘇珍， 等. 鉛（Pb）脅迫對路易斯安那鳶尾生長和生理生化特性的影響[J].植物資源與環境學報， 2014， 23（4）： 62-67.

責任編輯：趙軍明