針刺結(jié)合音樂療法對焦慮模型大鼠海馬Glu/GABA興奮/抑制平衡系統(tǒng)的影響

鄭　蔚,趙日霞,劉海靜

(云南中醫(yī)學(xué)院針灸推拿康復(fù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

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針刺結(jié)合音樂療法對焦慮模型大鼠海馬Glu/GABA興奮/抑制平衡系統(tǒng)的影響

鄭蔚,趙日霞,劉海靜

(云南中醫(yī)學(xué)院針灸推拿康復(fù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

[摘要]目的通過觀察針刺結(jié)合音樂療法對焦慮模型大鼠海馬谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)含量和二者比值的影響，探討此方法的部分抗焦慮機制。方法將50只雄性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、針刺組、音樂組和針刺音樂組，每組10只。除空白組外，其余組大鼠均給予連續(xù)21 d不可預(yù)見性的刺激，同時針刺組、音樂組及針刺音樂組在每次刺激前1 h給予相應(yīng)的針灸及音樂干預(yù)。實驗結(jié)束后取各組大鼠的海馬，采用高效液相色譜檢測法分析各組樣本中Glu和GABA含量。結(jié)果模型組大鼠海馬Glu含量及Glu/GABA比值均明顯高于空白組(P均<0.05)，GABA含量明顯低于空白組(P<0.05)。針刺組和針刺音樂組Glu含量及Glu/GABA比值均明顯低于模型組(P均<0.05)，針刺組、音樂組和針刺音樂組GABA含量均明顯高于模型組(P均<0.05)，針刺組和針刺音樂組各指標比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論針刺結(jié)合音樂療法抗焦慮作用與其海馬Glu/GABA平衡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]焦慮；針刺療法；音樂療法；谷氨酸；γ-氨基丁酸；海馬；大鼠

焦慮癥已成為現(xiàn)代社會常見的精神類疾病，雖其病因和發(fā)病機制尚未完全明了，但有研究表明，神經(jīng)遞質(zhì)間的失平衡是導(dǎo)致焦慮癥發(fā)病的重要機制之一[1]。谷氨酸(Glu)/γ-氨基丁酸(GABA)的平衡對于維持神經(jīng)細胞抑制與興奮功能平衡的穩(wěn)定具有極為重要的作用。許多學(xué)者認為，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)這個穩(wěn)態(tài)平衡被打破，就可能產(chǎn)生焦慮、抑郁、雙相情感障礙等精神類疾病[2]。針對焦慮癥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要使用抗焦慮藥物進行治療，但因其有耐藥性、成癮性以及較大的不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者依從性較差，從而嚴重影響了臨床療效。近幾年，大量臨床研究顯示針灸對于焦慮障礙有確切的療效[3-5]。而音樂治療能改善患者的焦慮、抑郁情緒，增強主動性，對癥狀的改善起一定作用[6]。本研究對照觀察了針刺療法、音樂療法和針刺結(jié)合音樂療法干預(yù)后焦慮模型大鼠海馬Glu、GABA含量和Glu/GABA比值的變化，以探討上述療法抗焦慮的機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1實驗資料

1.1實驗動物選用SD雄性大鼠60只,體質(zhì)量180～220 g，動物及飼料均由云南中醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所提供,合格證號:No.0018163。實驗室溫度保持在(23±2)℃,濕度70%～80%,安靜。動物在實驗前置于7:00—19:00光照、19:00—7:00黑暗的實驗室中適應(yīng)性馴養(yǎng)7 d,動物自由進食、飲水。

1.2主要實驗儀器及試劑高架十字迷宮( elevated plus- maxe, EPM) 和曠場實驗(Open-field test)均采用國際通用方法自制；日本島津LC-20A高效液相色譜儀，包括在線脫氣機DGU-20A3R(C)、二元泵LC-20AB、自動進樣器SIL-20A、柱溫箱CTO-20A、檢測器SPD-20A；H1650R型湘儀臺式高速冷凍離心機；GABA和Glu標準品，批號為20120322和140624-200805，分別為上海源葉生物科技有限公司和中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；色譜乙腈和色譜甲醇為美國Sigma公司產(chǎn)品；Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.3動物分組及處理方法馴養(yǎng)7 d后，通過曠場實驗將垂直運動次數(shù)和水平運動次數(shù)相加次數(shù)不足30次或超過120次的大鼠剔除后[7]進行編號，查隨機數(shù)字表分為空白組、模型組、針刺組、音樂組和針刺音樂組，每組10只。于第8天起，除空白組外，其余組動物均采用不可預(yù)知慢性情緒應(yīng)激(CES)刺激的方法復(fù)制焦慮模型[8-9]，即接受連續(xù)21 d不可預(yù)見性刺激，包括電擊足底、禁水1 h、禁食1 h、24 h光照、24 h黑暗、兩籠混為一籠、單籠、傾斜、從兩籠各抓1～2只混籠共9種應(yīng)激刺激，用SPSS 16.1統(tǒng)計軟件包transform將此9種刺激隨機分配到21 d中，每天安排1種應(yīng)激刺激。自實驗第1天起，模型組給予上述造模刺激；針刺組參照《實驗針灸學(xué)》[10]大鼠穴位定位，取百會、內(nèi)關(guān)、三陰交，采用針身長度為2 mm的32號麥粒型皮內(nèi)針針刺百會，針身長度為5 mm的32號圖釘型皮內(nèi)針針刺內(nèi)關(guān)和三陰交，每次留針30 min，1次/d，每次干預(yù)結(jié)束1 h后對大鼠進行造模刺激；音樂組將大鼠置于黑暗密閉空間，用錄音機播放音樂45 min，1 h后進行造模刺激；針刺音樂組大鼠進行針刺治療留針期間進行音樂治療，治療結(jié)束1h后進行造模刺激。

1.4GABA及Glu指標檢測

1.4.1取材及處理干預(yù)21 d后，大鼠經(jīng)7%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取出全腦，冰上分離出海馬，稱質(zhì)量；加入預(yù)冷的生理鹽水，冰上電動勻漿(25 000 r/min，10 s)，勻漿液經(jīng)4 ℃離心(12 000 r/min)20 min，取上清，加3倍體積乙腈，混勻后經(jīng)4 ℃離心(12 000 r/min)10 min沉淀變性蛋白，取1 mL上清液于離心管中(剩余上清液先置于-20 ℃預(yù)冷24 h，而后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用帶孔封口膜封住離心管口，自然揮干，用1 mL甲醇充分溶解后，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待測。

1.4.2GLU、GABA含量測定方法采用HPLC紫外結(jié)合異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate, PITC)柱前衍生技術(shù)測定。①色譜條件：Hypersil GOLD C18色譜柱，250 mm×4.6 mm ，5 μm；柱溫40 ℃。檢測波長：254 nm。②流動相包括A液和B液。流動相(A)：稱取醋酸鈉4.1 g，溶于1 000 mL超純水中，經(jīng)0.45 μm濾膜真空抽濾，以20∶1體積加入色譜級甲醇，利用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為5.5，超聲脫氣20 min，現(xiàn)配現(xiàn)用；流動相(B)：100%乙腈。線性梯度：在0～40 min內(nèi)，流動相B以線性從0上升到100%。流量：1 mL/min。

2結(jié)果

模型組大鼠海馬Glu含量及Glu/GABA值均明顯高于空白組(P均<0.05)，GABA含量明顯低于空白組(P<0.05)。針刺組和針刺音樂組大鼠海馬Glu含量及Glu/GABA值均明顯低于模型組(P均<0.05)，針刺組、音樂組和針刺音樂組大鼠海馬GABA含量均明顯高于模型組(P均<0.05)。針刺組和針刺音樂組各指標比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1　各組大鼠海馬Glu和GABA含量及比值比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3討論

焦慮癥現(xiàn)又稱焦慮障礙，指的是以廣泛和持續(xù)性焦慮或反復(fù)發(fā)作的驚恐不安為主要特征的神經(jīng)癥性障礙,臨床上將其分為廣泛性焦慮(GAD)和驚恐障礙(PD)2個類型。焦慮癥的發(fā)病機制十分復(fù)雜，尚不完全明了，近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)遞質(zhì)(如單胺神經(jīng)遞質(zhì)、γ-GABA、Glu等)、神經(jīng)肽[促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRF)、神經(jīng)肽Y(NPY)等]以及相關(guān)受體和基因表達的異常等均有關(guān)[11-13]。而早有研究表明，中樞4大神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)及GABA之間的失平衡是導(dǎo)致焦慮產(chǎn)生的重要機制之一[14-15]。海馬、大腦皮質(zhì)等邊緣結(jié)構(gòu)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的異常升高均可引起焦慮情緒的產(chǎn)生[16-17]。Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，生理濃度的Glu對于維持細胞的正常生理活動是必需的，如果Glu濃度和作用時限超出生理范圍，則會產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，損傷神經(jīng)元。而GABA是腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其不能透過血腦屏障, 腦組織中的 GABA 均由 Glu 經(jīng)谷氨酸脫羧酶脫羧而生成,兩者代謝的平衡改變可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能改變。

本研究結(jié)果顯示，焦慮模型大鼠海馬Glu含量顯著升高，GABA含量顯著下降，Glu/GABA顯著升高。提示焦慮的形成與海馬Glu/GABA平衡失調(diào)有關(guān)。針刺組和針刺音樂組Glu含量及Glu/GABA比值均顯著低于模型組，GABA含量顯著高于模型組。音樂組略有下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示針刺療法或針刺結(jié)合音樂療法均能不同程度下調(diào)焦慮模型大鼠升高的海馬Glu含量，上調(diào)下降的海馬GABA含量，從而糾正大鼠海馬Glu /GABA 興奮/抑制系統(tǒng)的失衡狀態(tài)。其中針刺療法和針刺結(jié)合音樂療法較單純音樂療法對焦慮模型大鼠海馬Glu/GABA興奮/抑制平衡系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用更為顯著，而針刺療法與針刺音樂療法的作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示針刺音樂療法及針刺療法對焦慮模型大鼠海馬Glu/GABA興奮/抑制平衡系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用肯定，而音樂療法雖然在臨床上有一定抗焦慮作用，但對大鼠海馬Glu/ GABA 系統(tǒng)影響不顯著，這可能與動物對音樂的感受性有關(guān)，也可能音樂療法需要更長的時間和療程，其更深入的機制尚待進一步研究。

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Study on the effects of acupuncture combined with music therapy on the balance excitatory and inhibitory of hippocampal Glu/GABA in anxiety model rats

ZHENG Wei, ZHAO Rixia, LIU Haijing

(Acupuncture and Massage Rehabilitation College of Yunnan University of TCM, Kunming 650500, Yunnan, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of acupuncture combined with music therapy on the content and ration of Glu/GABA in hippocampus in anxiety model rats, and approach the anti-anxiety mechanism. Methods 50 cases of male SD rats were randomly divided into blank group, model group, acupuncture group, music group and acupuncture combined with music group with 10 rats in each group. Except the blank group, the other animals were used in unpredictable chronic emotional stress method (Chronic Emotional Stress, CES) for 21 days to make anxiety model; at the same time, the animals of music group, acupuncture group, acupuncture combined with music group in 1 hours before each stimulus were gave the corresponding acupuncture or music therapy. After experiment, the hippocampi of rats in each group were extracted to detect the Glu and GABA contents by using high efficiency liquid chromatography. Results Compared with the blank group, the concentration of Glu and the value of Glu/GATA were significantly increased and the concentration of GABA was significantly reduced in the model group (all P<0.05). The concentration of Glu and the value of Glu/GATA of acupuncture group and acupuncture combined with music group were significantly reduced and the concentration of GATA were significantly increased than those of the model group (all P<0.05); but there was no significant difference between acupuncture group and acupuncture combined with music group (all P>0.05). Conclusion Anti-anxiety mechanism of acupuncture combined with music therapy is related to the function of regulating the concentration of Glu/GABA in hippocampus.

Key words:anxiety; acupuncture therapy; music therapy; Glu; GABA; hippocampus; rat

[收稿日期]2015-09-01

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)09-0917-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.09.002

[基金項目]云南白藥、云南中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥教育創(chuàng)新基金項目(2014011)

[作者簡介]鄭蔚，女，研究生，研究方向為針灸治療心身疾病的臨床研究。[通信作者]劉海靜，E-mail:luckylhj2004@163.com