槐耳清膏對手術切除結腸癌后腫瘤復發及轉移的影響及其機制研究

劉　華,楊貴義，欽傳輝

(湖北醫藥學院附屬隨州醫院,湖北 隨州 441300)

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槐耳清膏對手術切除結腸癌后腫瘤復發及轉移的影響及其機制研究

劉華,楊貴義，欽傳輝

(湖北醫藥學院附屬隨州醫院,湖北 隨州 441300)

[摘要]目的探討槐耳清膏對手術切除結腸癌后腫瘤復發及轉移的影響及其作用機制。方法將實施結腸癌根治性手術的患者64例按照隨機數字表法分為2組，對照組僅進行常規治療，治療組在常規治療基礎上同時服用槐耳清膏。觀察患者腫瘤復發及轉移情況，通過免疫組織化學法檢測人巨噬細胞金屬彈力酶(HME)和血管內皮生長因子(VEGF)的表達，并通過Western blot測定缺氧誘導因子1-α(HIF-1α)的表達。結果治療組的復發率和淋巴結轉移率明顯低于對照組(P均<0.05)。2組中發生復發轉移患者的HME表達均較弱，VEGF表達均較強，2組比較差異無統計學意義(P均>0.05)；而未發生復發轉移患者中治療組HME表達顯著強于對照組(P<0.05)，VEGF表達顯著弱于對照組(P<0.05)。2組已發生復發轉移患者的HIF-1α蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；而未發生復發轉移患者中治療組HIF-1α表達低于對照組(P<0.05)。治療組復發轉移患者HME、VEGF及HIF-1α蛋白表達與未復發轉移患者相比有統計學意義(P均<0.05)。結論槐耳清膏對結腸癌切除術后的轉移和復發有顯著改善作用，且可以增強患者HME表達，抑制VEGF的表達，同時降低HIF-1α表達。其作用機制可能與其抗血管生成作用有關。

[關鍵詞]槐耳清膏；結腸癌；人巨噬細胞金屬彈力酶；血管內皮生長因子；缺氧誘導因子；復發轉移

結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，手術根治性切除是其主要治療方法，但效果并不理想。手術后復發和轉移是導致結腸癌手術失敗和患者生存率低的主要原因[1-2]。槐耳清膏[3]是藥用真菌槐耳發酵后的熱水提取物，含有多種有機成分和礦物質元素，蛋白多糖是其發揮抗癌作用的活性成分。已有研究表明，槐耳清膏能夠促進腫瘤細胞的凋亡，抗腫瘤血管生成，對化療藥物有增敏和逆轉耐藥作用，能調節機體免疫等[4]，但對抑制結腸癌腫瘤術后轉移復發的研究未見報道。本研究選取2011年3月—2013年3月來我院實施結腸癌根治性手術的64例患者，分析槐耳清膏對手術切除結腸癌后腫瘤復發及轉移的影響及相關機制，旨在為臨床治療結腸癌提供實驗依據。

1臨床資料

1.1一般資料選取上述時期來我院實施結腸癌根治性手術的患者64例，均經病理學檢查確診為結腸癌，為首次手術；經2位醫生評估生存時間>3年；患者自愿參加本研究，簽署知情同意書。排除處于妊娠期、老年或兒童期；有其他重大并發癥者。術前診斷時均未發現臨床遠端轉移證據，術中亦未發現肝臟及遠處轉移的證據，手術前均未行放、化療治療，術后有明確的組織病理學診斷。按照隨機數字表法將患者分為2組：治療組32例，男24例，女8例；年齡(56±5)歲；腫瘤大小≤3 cm 14例，>3 cm 18例；按照Duke’s分期標準，A期 11例，B期9例，C期12例。對照組32例，男18例，女14例；年齡(55±4)歲；腫瘤大小≤3 cm 15例，>3 cm 17例；Duke’s分期：A期11例，B期11例，C期10例。2組一般資料比較差異無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2方法2組均給予結腸癌術后規范治療。在此基礎上，治療組服用槐耳清膏(醫院自制)，6～9 g/d，分3次服用，連續服用3～6個月；對照組不服用槐耳清膏。要求結腸癌患者術后1年內每隔3個月復查1次；2～5年內每隔6個月復查1次。至少完成3年隨訪。復發轉移病例經病理、CT、B超、X射線檢查4項中至少1項證實，病理切片通過再次手術或腸鏡檢查獲得；未復發病例結腸切片通過腸鏡檢查獲得。

1.3人巨噬細胞金屬彈力酶(HME)和血管內皮生長因子(VEGF)及缺氧誘導因子1-α(HIF-1α)表達檢測所有獲得的病理組織經4%多聚甲醛固定、乙醇梯度脫水、石蠟包埋，切片厚度4 μm。載玻片經多聚賴氨酸溶液預處理以防止脫片。采用過氧化物標記的鏈霉卵白素染色法(S-P法)，操作嚴格按照試劑盒(購自福州邁新公司)說明進行，使用羊抗人HME多克隆抗體和鼠抗人VEGF多克隆抗體(均購自Santa Cruz公司)按上述方法進行HME和VEGF的免疫組織化學染色。HME及VEGF主要定位于胞漿內，陽性者可見胞漿內的棕黃色顆粒，觀察組織的陽性細胞率及著色強度。采用Western blot法測定2組腫瘤組織中HIF-1α蛋白表達情況。

2結果

2.12組術后腫瘤復發和轉移情況在3年隨訪過程中經B超、CT或結腸鏡檢查發現，對照組有18例出現腫瘤復發，復發率為56%；治療組有6例出現腫瘤復發，復發率為18%。治療組復發率明顯低于對照組(P<0.05)。對照組有15例出現淋巴結轉移，有4例出現肝轉移，轉移率為59%；治療組有6例出現淋巴結轉移，2例出現肝轉移，轉移率為25%。治療組腫瘤轉移率明顯低于對照組(P<0.05)。

2.2HME、VEGF、HIF-1α在患者結腸癌組織內的表達HME陽性表達主要位于腫瘤細胞胞漿的中的棕黃色顆粒、間質中炎性細胞、部分成纖維細胞中；VEGF表達主要位于腫瘤細胞胞漿或胞膜，非癌組織中也可見表達。本研究中2組已發生復發轉移患者的HME表達差異比較差異無統計學意義(P>0.05)，而未發生復發轉移患者中治療組HME表達較對照組明顯升高(P<0.05)，且治療組內復發轉移與未復發轉移患者HME表達比較差異有統計學意義(P<0.05)。2組已發生復發轉移患者的VEGF的表達差異無統計學意義(P>0.05)，而未發生復發轉移患者中治療組VEGF表達較對照組降低(P<0.05)，且治療組內復發轉移與未復發轉移患者VEGF表達比較有統計學意義(P<0.05)。Western blot 檢測顯示2組已發生復發轉移患者的HIF-1α蛋白相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)，而未發生復發轉移患者中治療組HIF-1α的蛋白相對表達量較對照組顯著下降(P<0.05)，且治療組內復發轉移與未復發轉移患者HIF-1α蛋白相對表達量有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　2組術后組織內HME、VEGF水平及HIF-1α

注：①與復發轉移比較，P<0.05;②與對照組比較，P<0.05。

3討論

近年來，結腸癌的發病率逐年增高，占胃腸道腫瘤的第3位。其好發部位為直腸及直腸與乙狀結腸交界處，發病多在40歲以后，男女之比為(2～3)∶1。結腸癌的臨床表現隨其病灶大小所在部位及病理類型而有所不同。不少早期結腸癌患者在臨床上可毫無癥狀，但隨著病程的發展和病灶的不斷增大，可以產生一系列結腸癌的常見癥狀，諸如大便次數增多、大便帶血和黏液、腹痛、腹瀉或便秘、腸梗阻以及全身乏力、體重減輕和貧血等癥狀[5]。該病具有起病隱匿、早發現率低和預后差等特點，嚴重危及患者生命安全[6]。目前隨著診療技術的發展和人們健康意識的增加，早期結腸癌的診斷率和治療率明顯上升。手術仍是公認的治療結腸癌的方法之一。但是復發和轉移是導致結腸癌切除術失敗和患者死亡的主要原因，且有結腸癌家族史的患者為結腸癌術后復發的高危人群[7]。這些問題仍是困擾醫生和相關研究人員的焦點問題，因此研究結腸癌術后復發和轉移具有重要的臨床意義，能夠為采用科學合理的治療方案提供參考依據，以便最大限度地改善患者的預后。

中藥能調節機體免疫力，使術后患者的免疫系統功能得到恢復、增強，與化療有協同增效與減毒作用，特別對化療引起的消化道反應、造血機能抑制等有保護作用，故不僅在國內，在世界上一些發達國家也日益受到重視。對結腸癌術后患者，中醫一般采用益氣健脾、清熱解毒治法，根據辨證結果，還可結合通絡散結法，具體用藥因人而異，根據不同病期、不同體質、不同證型等情況，進行個體化治療[8]。

槐耳是我國民間中藥的藥用真菌，其味苦辛、性平無毒，有“治風”“破血”“益力”之功效[9]。化學分析其槐耳提取物槐耳清膏中槐耳多糖蛋白(PS-T)是主要活性成分，多糖蛋白為蛋白結合雜多糖，具有抗癌活性。其抗癌機制主要為促進巨噬細胞功能、誘導細胞因子、促進細胞免疫功能、提高體液免疫力、抑制腫瘤血管生成、誘導腫瘤細胞凋亡、逆轉耐藥細胞株等[10]。目前，臨床上已廣泛用于治療肝癌、乳腺癌及消化道惡性腫瘤。本文研究顯示，加用槐耳清膏治療后，結腸癌術后腫瘤復發率降低，淋巴結轉移和肝轉移速率降低，說明槐耳清膏具有一定地抑制結腸癌復發和轉移的作用。

由于結腸癌生長轉移是一個多階段、多步驟、多因素的發展過程，因此需要研究相關的生物活性產物在體內的表達[11]。HME是基質金屬蛋白酶家族(MMP)中的一員[12-13]。MMP已被證實可通過抑制腫瘤微血管生成來減少腫瘤體積和肝轉移的發生率，HME又稱為基質金屬蛋白酶12(MMP-12)，可使纖溶酶原轉化為血管穩定因子，是一種重要的腫瘤血管形成的抑制因子。HME在人結腸癌組織中的表達與腫瘤浸潤轉移呈負相關，可發揮抗腫瘤血管生成的作用。血管內皮生長因子也稱血管通透性因子(VPF)或促血管素，最初是由多種培養的腫瘤細胞系中發現的一種新型的生長因子，它能增加微血管與小靜脈血管的通透性[14-15]。后來發現，該因子特異性地作用于血管內皮細胞，并促進血管內皮細胞的增殖，所以定名為血管內皮生長因子。是目前所知的在腫瘤生長中作用最強、特異性最高的血管生成調控因子，在許多腫瘤新生血管的形成中起著關鍵作用，與結腸癌發展過程中新生血管的形成和轉移也有密切關系[16]。

本研究中，通過免疫組織化學法觀察2組術后復發患者和未復發患者間HME和VEGF表達的差異，結果顯示未復發轉移的患者中，治療組HME表達高于對照組，VEGF表達低于對照組，治療組內復發轉移與未復發轉移患者HME、VEGF表達有顯著性差異。提示槐耳清膏可以通過抗腫瘤血管生成作用，增強抑制患者HME，降低VEGF的表達，從而減少腫瘤的復發和轉移。缺氧誘導因子HIF-1α可通過調控多種靶基因表達以逃避或適應相對低氧環境，參與腫瘤生長、浸潤和轉移[17]。本研究治療組經槐耳清膏治療后，顯示未復發轉移的患者中HIF-1α表達降低，組內復發轉移與未復發轉移患者HIF-1α蛋白表達有顯著性差異。說明槐耳清膏抑制結腸癌腫瘤復發和轉移的機制與HME和VEGF的表達有關，通過抑制HIF-1α的生成，下調相關因子的表達，從而抑制腫瘤復發和轉移。進一步提示槐耳清膏有抗血管生成的作用。

綜上所述，槐耳清膏能夠抑制結腸癌腫瘤復發和轉移，抑制HIF-1α的表達，從而增強HME表達，下調VEGF的表達，起到了很好的抗腫瘤作用，為臨床進一步應用槐耳清膏治療結腸癌復發和轉移提供了實驗和理論依據，值得臨床推廣應用。但本研究所用樣本量有限，需進一步深入研究和驗證槐耳清膏的療效。

[參考文獻]

[1]Dinu D,Birla R,Caragui A,et al. Therapeutic strategies in colonic cancer[J]. Chirurgia (Bucur),2014,109(6):741-746

[2]梁建剛. 結腸癌手術治療進展[J]. 西南軍醫,2013,15(3):268-270

[3]關若丹,鄭遠,陳前軍. 槐耳顆粒防止可手術乳腺癌短期復發轉移的回顧性隊列研究[J]. 廣東醫學,2011,32(11):1490-1492

[4]姜南陽,朱安龍,樸大勛,等. 結直腸癌術后應用槐耳顆粒有效性分析[C]. 第十六屆中國中西醫結合學會大腸肛門病專業委員會學術會議，2013

[5]萬德森. 結直腸癌流行病學與預防[J]. 中國中西醫結合外科雜志,2011,17(1):3-7

[6]Aoyagi T,Terracina KP,Raza A,et al. Current treatment options for colon cancer peritoneal carcinomatosis[J]. World Journal of Gastroenterology,2014,35(12):12493-12500

[7]岳亞麗,鄭堅,朱瑩杰,等. 晚期結腸癌的全身治療進展[J]. 現代中醫結合雜志,2012,21(15):1701-1705

[8]陳文海,田逸,師彥敏,等. 中西醫結合治療晚期結腸癌療效觀察[J]. 現代中西醫結合雜志,2014,23(11):1172-1173

[9]沈澤天,武新虎,李兵,等. 槐耳顆粒聯合同步放化療治療局部晚期直腸癌的臨床研究[J]. 現代腫瘤醫學,2014,22(5):1114-1117

[10] 白巖. 槐耳清膏抑制結腸癌切除后腫瘤復發機制探討[J]. 山東醫藥,2013,53(38):33-35

[11] 宋鴻程. 老年結腸癌患者的病理特征及根治術后復發轉移的相關因素分析[J]. 現代中西醫結合雜志,2015,24(6):577-579

[12] Gauthier T,Siegerth F,Monteil J,et al. Follow-up of endometrial cancer[J]. Bull Cancer,2014,101(7/8):741-747

[13] Szmida E,Karpiński P,Leszczynski P,et al. Aberrant methylation of ERBB pathway genes in sporadic colorectal cancer[J]. J Applied Genetics,2015,56(2):185-192

[14] 劉剛. 基于中醫“治未病”理論的大腸腫瘤的防治及其與VEGF的關系[D]. 廣州:廣州中醫藥大學,2013

[15] Kjaer-Frifeldt S,Fredslund R,Lindebjerg J,et al. Prognostic importance of VEGF-A haplotype combinations in a stage Ⅱcolon cancer population[J]. Pharmacogenomics,2012,13(7):763-770

[16] Huang SM,Chen TS,Chiu CM,et al. GDNF increases cell motility in human colon cancer through VEGF-VEGFR1 interaction[J]. Endocr Relat Cancer，2013,21(1):73-84

[17] Hoenig MR,Bianchi C,Rosenzweig A,et al． Decreased vascular repair and neovascu larization with ageing: mechanisms and clinical relevance with an emphasis on hypoxia-inducible factor-1[J]. Curr Mol Med,2008,8(5):754-767

[收稿日期]2015-06-23

[中圖分類號]R735.35

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)09-0968-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.09.020