PHF8基因對食管鱗狀細胞癌裸鼠移植瘤生長的影響

朱圣韜　孫秀靜　李　鵬　郭慶東　朱圣泉　張澍田*

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院消化內科，北京 100050；2.國家消化系統疾病臨床醫學研究中心， 北京 100050； 3.首都醫科大學消化病學系， 北京 100050；4.首都醫科大學附屬北京天壇醫院消化內科， 北京 100050)

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PHF8基因對食管鱗狀細胞癌裸鼠移植瘤生長的影響

朱圣韜1，2，3孫秀靜2，3，4李鵬1，2，3郭慶東1，2，3朱圣泉1，2，3張澍田1，2，3*

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院消化內科，北京 100050；2.國家消化系統疾病臨床醫學研究中心， 北京 100050； 3.首都醫科大學消化病學系， 北京 100050；4.首都醫科大學附屬北京天壇醫院消化內科， 北京 100050)

【摘要】目的利用慢病毒(lentivirus)介導的短發卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)建立人食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC，以下簡稱食管鱗癌)裸鼠移植瘤模型，觀察鋅指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8，PHF8)對移植瘤生長的影響。方法分別將未感染慢病毒(空白對照組)、感染Nonsilencing-shRNA慢病毒(陰性對照shRNA組)和PHF8 shRNA慢病毒(PHF8 shRNA組)的人食管鱗癌細胞系TE-1接種于裸鼠背部皮下，建立食管鱗癌裸鼠移植瘤模型。定期測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。4周后處死裸鼠，定量PCR及Western blotting法檢測腫瘤組織中PHF8的表達。結果PHF8 shRNA組較陰性對照shRNA組、空白對照組的裸鼠致瘤能力明顯減弱，PHF8 mRNA和蛋白的表達水平顯著降低。結論慢病毒介導的shRNA干擾能有效減少食管鱗癌裸鼠移植瘤中PHF8的表達，而降低PHF8的表達能抑制食管鱗癌移植瘤的生長。

【關鍵詞】PHD鋅指蛋白8；慢病毒；食管鱗狀細胞癌；裸鼠移植瘤

我國是食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma， ESCC，以下簡稱食管鱗癌)的高發國家。目前已知，表觀遺傳學參與包括食管鱗癌在內的多種腫瘤的發生發展，某些組蛋白去甲基化酶(histone demethylase， KDM)在腫瘤的發病過程中起關鍵作用。PHD鋅指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8， PHF8)是近年來新發現的一種組蛋白去甲基化酶，在體內通過對組蛋白的賴氨酸殘基進行去甲基化修飾來調節基因的表達[1]。

筆者既往研究[2]以食管鱗癌細胞系為研究對象，通過慢病毒介導的shRNA技術建立了PHF8表達沉默的食管鱗癌穩定細胞系，并且體外研究[3]證實PHF8影響食管鱗癌細胞的增生、凋亡、克隆形成、遷移和侵襲能力。本研究利用上述已建立的食管鱗癌細胞系，進一步探討PHF8基因對食管鱗癌裸鼠移植瘤生長的影響。

1材料與方法

1.1 材料

人食管鱗癌細胞系TE-1由美國MD Anderson Cancer Center徐曉春教授惠贈。感染慢病毒Non-silencing shRNA和PHF8 shRNA的人食管鱗癌TE-1細胞系由本中心實驗室保存。BALB/c 裸小鼠[實驗動物許可證號：SYXK(京)2012-0023]，SPF 級，鼠齡5周，體質量(19.42±1.28)g，雌性。遵照國家實驗動物飼養和使用指南，在實驗動物中心無特殊病原菌條件下分籠飼養。RPMI 1640 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，iScript反轉錄試劑盒購自美國Bio-Rad公司，SYBR Green PCR Master Mix購自美國ABI公司，PHF8抗體購自英國Abcam公司，β-actin抗體購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

各組食管鱗癌細胞TE-1系(PHF8 shRNA實驗組，Non-silencing shRNA 陰性對照組和Control空白對照組)[2]，用含10%(體積分數)胎牛血清的RPMI 1640培養基，于37 ℃ 含5%(體積分數) CO2培養箱中培養，細胞生長達70%～80%融合時進行傳代。

1.2.2實驗動物模型的制備及分組

將21只BALB/c 裸小鼠應用隨機數字表進行完全隨機化，分為3組，每組7只，分別注射PHF8 shRNA實驗組、Non-silencing shRNA 陰性對照組和Control空白對照組的TE-1細胞。取對數生長期的各組食管鱗癌細胞，經胰蛋白酶消化后，制備單細胞懸液，用1×PBS 洗滌細胞3 次，計數并用PBS 重懸、調整細胞密度為4×107/mL。用1 mL 注射器抽取瘤細胞懸液接種于裸鼠一側背部皮下，每個接種部位0.1 mL，含活細胞數4×106。

1.2.3觀察指標與測定方法

在裸鼠成瘤實驗期間，定期觀察裸鼠的精神、飲食、體質量等及有無異常情況。每隔3 d測量裸鼠的體質量、腫瘤結節的長度(L)和寬度(W)。繪制腫瘤生長曲線。腫瘤體積的計算公式為：V=0.5×L×W2。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測目的基因表達

收集各組裸鼠移植瘤組織并勻漿，應用Qiagen公司的RNA提取試劑盒提取組織總RNA，Bio-Rad公司的iScript反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA，隨后應用ABI公司的SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，在7500 實時熒光定量PCR儀上完成實時熒光定量PCR檢測。引物的序列如下：內參照GAPDH：sense：5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′，antisense：5′-GCGCCCAATACGACCAAAT-3′；目的基因PHF8：sense：5′-GACATGTGCCAGGACTGGTTT-3′，antisense：5′-CAGCAGCCTTCTCCTCTTCAA-3′。

1.2.5Western blotting法檢測目的蛋白表達

提取各組移植瘤組織總蛋白后BCA法蛋白定量，40 μg的蛋白樣品變性后進行SDS-PAGE蛋白分離，將蛋白轉移至PVDF膜，5%(質量分數)牛血清白蛋白室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育搖床過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學發光鑒定。β-actin為內參。

1.3 統計學方法

2結果

2.1各組裸鼠的可比性

各組實驗動物均在皮下注射后1周左右成瘤，成瘤率100%。至實驗結束，動物生長良好，精神、飲食及活動等方面均無異常。各組動物體質量隨周數增加而增加，重復測量數據的方差分析結果顯示，各組間體質量隨時間的變化差異無統計學意義 (F=0.003，P>0.05)，具有可比性，詳見表1。

2.2各組裸鼠移植瘤體積的比較

各組實驗動物的移植瘤的體積隨時間增加而增大。重復測量數據方差分析結果顯示，不同組間比較差異有統計學意義(F=7.78，P<0.01)。與陰性對照shRNA組和空白對照組比較，PHF8 shRNA實驗組的瘤體增長速度慢、體積小(P<0.05)，兩對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。進一步繪制腫瘤生長曲線(圖1)，表明PHF8的表達沉默可使人食管鱗癌裸鼠移植瘤的瘤體生長明顯受抑制。

2.3各組裸鼠移植瘤PHF8的表達

應用實時熒光定量PCR和Western blotting方法檢測各組移植瘤組織PHF8 mRNA和蛋白的表達水平，可見實驗組PHF8的表達量明顯低于陰性對照組和空白對照組，兩對照組比較差異無統計學意義(圖2)，這表明在裸鼠移植瘤實驗中PHF8的表達沉默持續有效。

圖1　各組裸鼠移植瘤的生長曲線

GroupNumberofcasesWeek0Week1Week2Week3Week4PHF8shRNA719.23±1.8621.10±1.7022.50±1.5623.43±1.9524.33±1.91Non-silencingshRNA719.21±1.2720.91±1.1822.63±1.0023.61±1.0424.44±1.15Control719.24±1.4421.00±1.4022.47±1.5623.57±1.4924.51±1.60

PHF8: plant homeodomain finger protein 8.

表2各組實驗動物的腫瘤體積

Tab2. Tumor volume of each group

GroupNumberofcasesWeek1Week2Week3Week4PHF8shRNA755.12±23.53251.00±67.04704.56±159.541367.93±281.05Non-silencingshRNA767.70±33.43337.76±55.751013.29±183.792025.99±479.75Control772.70±34.71364.70±61.691134.20±231.842197.86±453.57

The tumor volume of each group was increased as times went on. As compared with non-silencing shRNA group and control group， the tumor growth of PHF8 shRNA group was slow and the tumor volume decreased significantly (P<0.05). However， no significant weight differences were observed in mice between non-silencing shRNA group and control group (P>0.05)； PHF8: plant homeodomain finger protein 8.

圖2　裸鼠移植瘤中PHF8的表達

A: expression levels of PHF8 mRNA determined by quantitative real-time PCR (n=5). B: Western blotting analysis of PHF8 protein levels. β-actin served as the internal reference；1 and 2 are the representative picture of different treat groups；*P<0.05； PHF8: plant homeodomain finger protein 8.

3討論

近年來，表觀遺傳學(epigenetics)與腫瘤形成之間的關系越來越受到重視，其研究為腫瘤的發生和發展提供了新的理論基礎，并為腫瘤的診斷和治療提供了新的手段[4]。表觀遺傳是指沒有DNA序列變化的、可遺傳的基因表達改變[5]。它有3個特點：(1)可遺傳的，即這類改變能夠通過有絲分裂或減數分裂，在細胞或個體世代間傳遞；(2)可逆性的基因表達調控；(3)沒有DNA序列變化或者不能用DNA序列的變化解釋。異常的表觀遺傳修飾會使基因錯誤地表達，引起發育異常、代謝紊亂和疾病，甚至腫瘤的發生，因此表觀遺傳修飾對于研究個體發育以及腫瘤的發生、診斷和治療等方面具有重大意義[6]。

當前表觀遺傳學的研究內容主要集中在3個方面：DNA 甲基化修飾(DNA methylation)、組蛋白共價修飾(covalent histone modification)和非編碼RNA(non-coding RNAs)。其中組蛋白修飾是表觀遺傳調控的重要組成部分，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化和ADP核糖基化等，它們分別由不同的組蛋白修飾酶催化，通過改變染色質的結構以及與其他調控蛋白相互作用，調節真核基因的表達[7]。

組蛋白甲基化(histone methylation)是表觀遺傳學的研究內容之一。同大多數表觀遺傳改變一樣，它是一個可逆的過程。組蛋白甲基化與組蛋白去甲基化(histone demethylation)分別由組蛋白甲基轉移酶(histone methyltransferase)和組蛋白去甲基化酶(histone demethylase)催化[8]。組蛋白去甲基化酶是催化甲基化的組蛋白發生去甲基化的組蛋白修飾酶。自2004年第1個組蛋白賴氨酸去甲基化酶被發現以來，目前已發現30多種，而其中的大部分已經被證實與乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌、白血病、淋巴瘤等多種腫瘤的發生發展有關[9-11]。

PHD鋅指蛋白8(PHF8)是近年來新發現的一種組蛋白去甲基化酶。有研究[12-14]顯示，PHF8參與調節細胞的增生、凋亡、分化及運動等生物學行為。但是關于PHF8是否參與腫瘤的發生和發展，目前研究仍處于起始階段。Bj?rkman等[15]的研究表明PHF8在前列腺癌中有過表達，敲除PHF8抑制前列腺癌細胞的增生、遷移和侵襲，這與筆者在食管鱗癌細胞的體外研究[3]結果一致，但關于PHF8功能的體內動物實驗目前國內外尚無報道。筆者利用裸鼠移植瘤模型研究PHF8表達沉默對食管鱗癌細胞體內腫瘤生長的影響。將不同處理組的TE-1細胞分別給裸鼠皮下注射，每只裸鼠注射一種細胞。各組實驗動物均在皮下注射后1周左右成瘤，成瘤率100%。至實驗結束，動物生長良好，精神、飲食及活動等方面均無異常。各組動物體質量隨周數增加而增加，各組間體質量差異無統計學意義，具有可比性。隨著時間的增加，各組實驗動物的移植瘤逐漸增大，與陰性對照組和空白對照組比較，實驗組的瘤體增長速度慢、體積小，表明PHF8基因表達沉默抑制食管鱗癌細胞的體內致瘤能力。

本研究結果證實，慢病毒介導的shRNA干擾能夠有效、持續地沉默食管鱗癌細胞移植瘤中組蛋白去甲基化酶PHF8的mRNA和蛋白表達。并且，PHF8的表達沉默能夠抑制食管鱗癌裸鼠移植瘤的生長，提示PHF8可能參與了食管鱗癌的發病。但腫瘤的病因及發病機制復雜，單一組蛋白的修飾往往不能獨立地發揮作用，關于組蛋白去甲基化酶的機制，特別是與其他組蛋白修飾間相互作用的具體機制尚不太清楚，因此，組蛋白去甲基化酶雖然與腫瘤有關，但要從分子水平來闡明兩者之間的關系尚需進一步的研究。令人鼓舞的是腫瘤表觀遺傳治療的有效性已經得到認可，另一類組蛋白修飾酶——去乙酰化酶已成為臨床腫瘤治療的靶點，調節組蛋白去甲基化酶的活性將成為防治腫瘤的新思路和藥物開發的新方向[16-18]。

4參考文獻

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編輯陳瑞芳

Effect ofPHF8 gene on the growth of transplanted tumor of esophageal squamous-cell carcinoma in nude mice

Zhu Shengtao1，2，3， Sun Xiujing2，3，4， Li Peng1，2，3， Guo Qingdong1，2，3， Zhu Shengquan1，2，3， Zhang Shutian1，2，3*

(1.DepartmentofGastroenterology，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China； 2.NationalClinicalResearchCenterforDigestiveDiseases，Beijing100050，China； 3.FacultyofGastroenterology，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China； 4.DepartmentofGastroenterology，BeijingTiantanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China)

【Abstract】ObjectiveTo establish nude mice models with implanted tumor of esophageal squamous-cell carcinoma cells， and to observe the effects of PHF8 gene on the growth of implanted tumor. MethodsNude mice were injected subcutaneously into their right posterior flank with human TE-1 esophageal squamous-cell carcinoma cells (control group)， lentivirus mediated Non-silencing shRNA TE-1 cells (Non-silencing shRNA group)， or lentivirus mediated PHF8 shRNA TE-1 cells (PHF8 shRNA group)， respectively. The size of implanted tumor was measured at regular intervals and the growth curve of tumor was portrayed. Animals were sacrificed at 4 weeks， and the silencing of PHF8 in tumor tissues was confirmed by real-time PCR and Western blotting.ResultsThe tumorigenic effect on nude mice was weaker and lower in PHF8 shRNA group， as compared to those in Non-silencing shRNA group and control group. The expression of PHF8 mRNA and protein in PHF8 shRNA group was significantly decreased. ConclusionLentivirus mediated shRNA effectively inhibited the expression of PHF8 in transplanted tumor of nude mice with human esophageal squamous-cell carcinoma cell lines， and the tumorigenic ability was significantly reduced.

【Key words】PHD finger protein 8; lentivirus; esophageal squamous cell carcinoma; transplanted tumor in nude mice

(收稿日期：2015-12-25)

【中圖分類號】R 735.1

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.003]

*Corresponding author， E-mail：zhangshutian@ccmu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(81302160， 81272447)，國家消化系統疾病臨床醫學研究中心基金(2015BAI13B09)，北京市醫院管理局青苗人才計劃(QML20150507)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81302160， 81272447)， National Clinical Research Center for Digestive Diseases (2015BAI13B09)， Beijing Municipal Administration of Hospitals’ Youth Programme (QML20150507).

網絡出版時間：2016-01-2716∶03網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1603.004.html

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