PINK1減輕α-突觸核蛋白引起的線粒體損傷

王　雪　申甲梅　高　歌　段春禮　魯玲玲　楊　慧

(首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系 北京腦重大疾病研究院 帕金森病研究所 教育部神經變性病重點實驗室， 北京 100069)

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PINK1減輕α-突觸核蛋白引起的線粒體損傷

王雪申甲梅高歌段春禮魯玲玲楊慧*

(首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系 北京腦重大疾病研究院 帕金森病研究所 教育部神經變性病重點實驗室， 北京 100069)

【摘要】目的證明PINK1對α-突觸核蛋白 (α-synuclein， α-syn) 引起的線粒體損傷的影響。方法將攜帶人源PINK1 和α-syn基因的質粒共轉染MN9D多巴胺能神經細胞，流式細胞術檢測細胞內活性氧 (reactive oxygen species， ROS)、線粒體滲透性轉運孔 (mitochondrial permeability pore， mPTP) 的開放情況及線粒體膜電勢 (ΔΨm) 變化；MTT和乳酸脫氫酶法檢測細胞活力及細胞損傷情況。 結果PINK1減少α-syn引起的ROS的生成、線粒體膜孔的開放及線粒體膜電勢降低，并減輕α-syn所致細胞活力下降及和細胞損傷。結論PINK1可以減輕α-syn引起的線粒體損傷。

【關鍵詞】PINK1； α-突觸核蛋白； 線粒體

帕金森病 (Parkinson’s disease， PD) 是一種常見于老年人的中樞神經系統退行性疾病，其發病率僅次于阿爾茲海默癥，65歲以上人群患病率超過1 %[1]。其典型的病理特征為神經元內嗜酸性包涵體路易體 (Lewy bodies， LBs) 及路易神經突的 (Lewy neurites， LNs) 形成[2]。PD的發病因素不僅涉及遺傳，還有環境和老化等因素，而線粒體功能障礙是各種致病因素導致神經元退變的中心環節。α-突觸核蛋白 (α-synuclein， α-syn)過表達可以引起線粒體功能障礙[3-4]。過表達人源的α-syn可引起細胞內反應性氧自由基 (reactive oxygen species， ROS) 增高、線粒體孔的形成[5-7]。本實驗室近期結果[8]也證明，α-syn主要通過其氨基端引起線粒體膜孔 (mitochondrial permeability transition pore， mPTP) 異常開放及線粒體膜電勢 (ΔΨm) 降低，引起線粒體形態的改變從而損傷線粒體。

PD致病基因PINK1可以直接定位到線粒體的蛋白，對維持線粒體的功能和形態有重要作用。PINK1蛋白由581個氨基酸組成，包括氨基端的線粒體靶向序列 (1～32 氨基酸)，一個假定的跨膜區，中間的絲蘇氨酸激酶結構域 (156～509氨基酸) 以及羥基端的調節區[9-10]。PINK1的激酶活性對于它的神經保護作用至關重要。PINK1功能喪失可以導致線粒體的形態缺陷[11-13]、膜電勢下降[14-16]以及ROS的產生增加[17]，此外還可以通過減少細胞ATP的產生而對細胞起到損傷作用[18]。文獻[3-4]報道，突變的PINK1和α-syn 對線粒體功能的喪失有重要的影響。本實驗室前期研究[19-20]證明，PINK1可能與α-syn發生直接相互作用。然而，兩者如何相互作用影響神經元的線粒體功能進而影響神經元的退變尚不清楚。

1材料和方法

1.1 材料

MN9D細胞系：小鼠神經母細胞瘤細胞系N18TG2與原代C57BL/6J小鼠胚胎腹側中腦細胞融合形成的雜交瘤細胞 (Novartis公司Bastian Hengerer博士惠贈)；F12培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清 (fetal calf serum， FBS) 購自美國Thermo公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、5， 5′， 6， 6′-四氯-1，1′，3，3′-甲基苯并咪唑氫碘化物 (tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide, JC-1) 購自美國Sigma公司；2′， 7′-二氯熒光素-二酯 (dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA) 購自美國Sigma公司；MitoProbeTM Transition Pore Assay Kit 購自美國Invitrogen 公司；MTT購自美國Sigma公司，DMSO購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase， LDH)試劑盒購自瑞士Roche公司；人源PINK1及α-synuclein質粒pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1WT， pCMV-Myc-α-syn由本實驗室已構建。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染

MN9D細胞采用含10%(體積分數)FBS、100 U/mL青霉素和 100 U/mL鏈霉素的DMEM /F12培養基，置于 37 ℃的5% (體積分數) CO2培養箱中培養。質粒轉染按照Lipofectamine 2000操作說明書進行。

1.2.2活性氧的測定

MN9D細胞分組轉染48 h后，將細胞消化收集，離心后，加入PBS洗2遍，5 min/次，1 000 r/min， 1 min離心。用F12培養基將DCFH-DA貯存液1∶1 000稀釋，稀釋成染色液，其工作終濃度是10 μg/mL；棄PBS后，加1 mL 10 μg/mL DCFH-DA染色液，37 ℃，5%(體積分數) CO2培養箱內孵育15 min；吸棄染色液，以PBS洗滌細胞5 min， 3次，以洗去非特異熒光；以0.2 mL的PBS重懸細胞，利用流式細胞儀進行檢測。

1.2.3細胞線粒體膜滲透性轉運孔開放的檢測

轉染MN9D細胞48 h后，將各組細胞重懸在預熱的HBSS/Ca2+液中，細胞終密度為每毫升1 × 106個/細胞，將每組細胞再平均分為2個組，Calcein AM組與Calcein AM + CoCl2組；將1 mmol/L Calcein AM儲存液按1∶500 稀釋成2 μmol/L工作液；向Calcein AM組和Calcein AM + CoCl2組中分別加入5 μL Calcein AM工作液，混勻；向Calcein AM + CoCl2組中加入5 μL CoCl2，混勻；將每組樣品在 37 ℃條件下避光孵育15 min；加入約3 mL的HBSS/Ca2+到離心管中，1 000 r/min，5 min，離心收集細胞；向離心收集到的細胞中加入約400 μL PBS，1 h內進行流式細胞檢測。

1.2.4線粒體膜電位檢測

MN9D細胞轉染48 h后收集，以F12培養基稀釋JC-1貯存液至工作終質量濃度是10 μg/mL，37 ℃，5% (體積分數)CO2培養箱內孵育10 min 利用流式細胞儀進行檢測。

1.2.5MTT細胞活性測定

將各組的MN9D細胞用200 μL培養基按5×103個/孔的密度接種于96孔板。24 h后進行轉染，轉染48 h后，向各孔加入MTT (5 mg/mL) 20 μL，37 ℃，5%(體積分數)CO2培養箱培養4 h。吸棄培養基，每孔加入100 μL DMSO，小心吹打混勻，不要有氣泡。將孔板置于酶標儀中，讀取550 nm波長處的吸光度值，統計作圖。

1.2.6LDH 法細胞損傷程度檢測

(1)工作液的制備： 250 μL催化液和 11.25 mL染色液混合成工作液，現配現用。

(2)細胞毒分析步驟： 收集細胞，用分析液在96孔板中分別制備下列樣本：①背景對照：每孔加入200 μL正常培養液，復孔3個。計算結果時，用其他值減去背景值。低對照：向每孔加入分析液200 μL，細胞量約為1×104～2 × 104個，復孔3個。高對照：向每孔加入含1 %(體積分數)Triton X-100的分析液200 μL，細胞量約為1×104～2 × 104個，復孔3個。檢測樣本：向每孔加入含檢測物質的分析液200 μL，細胞量約為1×104～2 ×104個，復孔3個；在37 ℃，5% (體積分數) CO2培養箱中孵育細胞，孵育時間為檢測物質的適當處理時間；將細胞上清小心轉移到相應的新96孔板中，每孔100 μL；每孔加入100 μL現用現配的反應混合液，室溫避光孵育30 min。孵育完畢后，每孔加入50 μL終止液混勻終止反應。用微孔讀板儀在490 nm檢測樣本的吸光度值，后進行計算分析。

1.3 統計學方法

2結果

2.1PINK1抑制α-syn引起的細胞ROS增加

MN9D細胞接種于6孔板，分別過表達PINK1質粒或α-syn、空載質粒48 h后，DCFH-DA孵育，進行流式細胞術檢測細胞ROS。結果顯示，過表達α-syn組綠色熒光強度較空載組明顯升高，而同時過表達α-syn和PINK1組的綠色熒光強度與單獨表達α-syn組相比明顯減少，說明過表達PINK1挽救了α-syn引起的ROS明顯增加。上述結果提示，在 MN9D 細胞中，過表達PINK1可能緩解 α-syn引起MN9D細胞mPTP異常開放，線粒體膜的通透性異常增加(圖1)。

2.2PINK1抑制α-syn引起的mPTP開放

在MN9D細胞分別轉染及共轉染PINK1與α-syn質粒及其空載組，48 h后對各組不同細胞經流式細胞術檢測細胞mPTP的開放程度。結果顯示，各組細胞Calcein AM組熒光強度均相對一致，過表達α-syn 的MN9D細胞較空載組的Calcein AM + CoCl2組熒光強度明顯左移，而共轉染α-syn和PINK1的MN9D細胞Calcein AM + CoCl2組熒光強度與單獨表達α-syn峰值沒有明顯的左移，提示在 MN9D細胞中，過表達PINK1能夠抑制α-syn引起的MN9D細胞mPTP異常開放(圖2)。

2.3PINK1抑制α-syn引起的ΔΨm下降

MN9D細胞轉染各組質粒48 h后用JC-1孵育，然后用流式細胞儀檢測ΔΨm。膜電勢正常時，JC-1呈現紅色熒光；膜電勢下降時，JC-1呈現綠色熒光。結果顯示，過表達α-syn使ΔΨm明顯降低，與對照組相比較差異有統計學意義。在同時過表達PINK1和α-syn的細胞，ΔΨm下降程度明顯小于單純過表達α-syn的細胞，提示PINK1對α-syn引起的ΔΨm下降有抑制作用(圖3)。

圖1　過表達PINK1可以抑制α-syn過表達引起的細胞ROS增加

ROS levels were detected with dichlorofluorescein diacetate in MN9D dopaminergic cells transfected with plasmid of vector， hPINK1 wild type， or α-syn. Cells were harvested at 48 h after transfection. The fluorescent was determined by flow cytometry and signals were acquired for 20 000 events.**P<0.01vsvector group；#P<0.05vsα-syn group；n=3； α-syn:α-synuclein； ROS:reactive oxygen species.

圖2　PINK1抑制α-syn引起的線粒體膜孔異常開放

Fluorescence intensity was measured when loaded with Calcein AM with CoCl2in MN9D cell line transiently transfected with vector， α-syn， PINK1， α-syn + PINK1. Quantification of the fluorescence intensity was based on triplicates of three independent experiments and signals were acquired for 20 000 events.*P<0.05vsvector group；#P<0.05vsα-syn group；n=3；α-syn:α-synuclein； mPTP:mitochondrial permeability pore.

圖3　PINK1抑制α-syn引起的膜電位降低

Plasmids of vector， hPINK1 wild type or α-syn in MN9D cells. Cells were harvested at 48 h after transfection. Δψm was visualized by treating the transfected with the probe tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide (JC-1). Normal Δψm was detected as orange fluorescence from the aggregation of JC-1 monomers， while green fluorescence was associated with reduced Δψm as determined by flow cytometry. Signals were acquired for 20 000 events.*P<0.05vsvector group；#P<0.05vsα-syn group；n=3； α-syn:α-synuclein.

2.4PINK1抑制α-syn引起的細胞損傷

在MN9D 細胞轉染各組質粒48 h后，通過酶標儀測定轉α-syn質粒和空載體對細胞活力的影響。把各組的吸光度值所占百分比與空載組的比值進行統計，過表達α-syn細胞活力顯著降低；同時過表達PINK1和α-syn則明顯抑制了α-syn過表達引起的細胞活力下降。檢測細胞培養上清中LDH的活性判斷細胞受損的程度，通過LDH 試劑盒結合多標記微孔板檢測儀把各組的吸光度值所占百分比與空載組的比值進行統計，過表達α-syn組LDH顯著升高30 %；同時過表達PINK1和α-syn則明顯抑制α-syn過表達引起的LDH的增加，結果說明PINK1可以緩解α-syn引起的細胞毒性(圖4)。

圖4　PINK1抑制α-syn 引起的細胞活力的降低和LDH的釋放

MN9D cells were-transfected with vector， α-syn or hPINK1 wild type. Cell viability was assessed by MTT assay and the cell injury was evaluated by LDH release after 48 h transfected.**P<0.01vsvector group；#P<0.05;##P<0.01vsα-syn group；n=6；α-syn:α-synuclein； LDH: lactate dehydrogenase.

3討論

本研究發現，在MN9D多巴胺能神經細胞系中單純過表達人源性α-syn可以引起細胞ROS增加，從而引起線粒體損傷。其可能的機制有如下幾個方面：首先，α-syn基因轉染多巴胺能神經元可以同時增加胞質及線粒體的α-syn[10]；其次，文獻[21]報道α-syn可以降低線粒體氧化呼吸鏈complex Ⅰ的活性，而complex Ⅰ的功能降低使活性氧增加，這些活性氧誘發氧應激，從而損傷細胞；最后，α-syn的過表達可以導致細胞胞質內谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的下降，以及線粒體內氧化型谷胱甘肽升高，這也可以導致細胞ROS增加[22]。文獻[21，23]表明，細胞活性氧增高主要是由于線粒體損傷導致。所以進一步檢測α-syn是否導致線粒體損傷，結果表明α-syn的過表達可導致線粒體膜孔開放以及線粒體膜電位下降，其機制可能是由于α-syn包含可以與脂質結合的α-螺旋結構，而這個結構與膜定位密切相關，并且文獻[8]表明α-syn與線粒體心磷脂降低密切相關，并且和線粒體膜蛋白電壓依賴陰離子通道、腺嘌呤核苷酸轉運體之間具有相互作用。這可能是α-syn導致線粒體膜孔開放及膜電勢下降的原因。

本實驗結果表明，共表達PINK1和α-syn，通過檢測線粒體膜穩定性，發現PINK1可以挽救α-syn引起的ROS增高、膜電勢下降。本實驗室以往的研究[20]分別用免疫共沉淀、GST-pull-down和熒光共振能量轉移等方法發現α-syn和PINK1之間存在相互作用和胞質及線粒體內共定位。而通過PINK1與α-syn復合物的形成，可以有效地緩解單純α-syn在線粒體及胞質的濃度，進而可以有效地降低α-syn所致的ROS增高，并阻止α-syn與線粒體膜蛋白的共定位，最終發揮保護作用；同時文獻[24]報道PINK1可以直接定位于線粒體，具有穩定線粒體功能，維持線粒體Complex Ⅰ活性，緩解線粒體細胞色素C的釋放，從而對細胞起到保護作用[25-26]。

本實驗進一步證實，單純過表達α-syn可以引起細胞活力下降，可能與α-syn可以增加線粒體膜通透性、損傷線粒體功能、增加細胞內ROS[7-8，23]相關，而同時過表達PINK1后，可以發現PINK1明顯逆轉α-syn致細胞活力降低。

通過本實驗，本課題組深入研究了PINK1有效緩解α-syn致細胞損傷的作用，并且討論了其內在機制，即與線粒體功能、ROS的變化密切相關，這一結果可能為研究PD的致病機制提供新線索，并為未來開發新藥提供了潛在的科學依據。

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編輯孫超淵

Study ofPINK1 rescuing the mitochondrial dysfunction induced by α-synuclein

Wang Xue， Shen Jiamei， Gao Ge， Duan Chunli， Lu Lingling， Yang Hui*

(DepartmentofNeurobiology，SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity，CenterforParkinson’sDisease，BeijingInstituteforBrainDisorders，KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDiseasesoftheMinistryofEducation，Beijing100069，China)

【Abstract】Objective To identify whether PINK1 could rescue the mitochondrial dysfunction induced by α-synuclein. MethodsMN9D cells were transfected with plasmid encoding human α-synuclein together with human wild type PINK1. The level of reactive oxygen species (ROS)， mitochondrial permeability pore (mPTP) and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) were examined by flow cytometry. The cell viability was observed by MTT assay and release of lactate dehydrogenase(LDH) respectively. ResultsWhile overexpression PINK1 could ease the opening of mPTP， reducing the generation of ROS， ΔΨm reduction percentage reduction by α-syn， reversed α-syn decreased cell viability and induced LDH release by α-syn induced. ConclusionPINK1 could alleviate α-syn-induced mitochondrial injury.

【Key words】PINK1； α-synuclein (α-syn)； mitochondria

(收稿日期：2015-10-30)

【中圖分類號】R 741

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.014]

*Corresponding author， E-mail：huiyang@ccmu.edu.cn

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃項目(2011CB504102， 2012CB722407)，國家自然科學基金(81371398)，北京市自然科學基金(7131001)，北京市創新團隊建設提升計劃 (IDHT20140514)，北京腦重大疾病研究院項目(BIBD-PXM2013 014226 07 000084)，首都醫科大學校基金(2015JS21)。 This study was supported by Major State Basic Research Development Program of China (2011CB504102， 2012CB722407)， National Natural Science Foundation of China (81371398)，Natural Science Foundation of Beijing (7131001)， The Project of Construction of Innovative Teams and Teacher Career Development for Universities and Colleges Under Beijing Municipality (IDHT20140514)，Beijing Institute for Brain Disorders-PXM (BIBD-PXM2013 014226 07 000084)， Science Foundation of Capital Medical University(2015JS21).

網絡出版時間：2016-01-2718∶10網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1810.032.html

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