急性淋巴細胞白血病患兒MTHFR基因多態性與大劑量甲氨蝶呤毒副反應的相關性

廖 靜， 李 戈， 張 熔

(四川省人民醫院兒科， 成都 610072)

急性淋巴細胞白血病患兒MTHFR基因多態性與大劑量甲氨蝶呤毒副反應的相關性

廖 靜， 李 戈， 張 熔

(四川省人民醫院兒科， 成都 610072)

目的：探討亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因677位點多態性與急性淋巴細胞白血病(ALL)患兒使用大劑量甲氨蝶呤(HDMTX)化療后毒副反應的相關性。方法： 收集46例完全緩解并接受HDMTX治療的ALL患兒外周血，提取基因組DNA，用PCR-芯片雜交法檢測MTHFR基因C677T多態性。應用熒光偏振免疫法(FPIA)測定24小時、48小時血漿MTX濃度。按照國立癌癥研究所常規毒性判定標準(NCI-CTC)對患兒HDMTX化療毒副反應進行評價。對MTHFR677位點基因多態性與HDMTX毒副反應、48小時血漿MTX濃度的相關性進行分析。結果： HDMTX化療相關毒副反應以骨髓抑制及肝毒性為主。C677T各基因型的48h MTX血藥濃度及發生各類化療毒副反應差異無統計學意義。結論： 影響MTX的體內代謝及毒副反應的因素復雜，MTHFR C677T基因多態性尚不能作為HDMTX體內排泄及毒副反應的有效預測性指標。

亞甲基四氫葉酸還原酶； 單核苷酸基因多態性； 急性淋巴細胞白血病； 甲氨蝶呤； 毒副反應

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是兒童惡性腫瘤最常見的類型之一，隨著聯合化療方案的不斷改進，其5年無事件生存率(EFS)目前已可達80%[1]。大劑量甲氨蝶呤(high-dose methotrexate,HDMTX)在預防髓外白血病、殘留微小病灶的清除、減少復發、達到長期無病生存等方面發揮著難以替代的效應，但因其不同程度的毒副反應，使之在臨床應用中受到限制。

遺傳藥理學認為個體之所以對藥物具有不同的耐受性，人類基因組所具有的基因多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)為主要因素。藥物代謝酶基因多態性在ALL化療療效及毒副作用中發揮著至關重要的作用。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)是葉酸代謝途徑的關鍵酶之一，其編碼基因所具有的多態性是非常明顯的，本研究選擇MTHFR基因C677T位點作為研究對象，探討此基因多態性和HDMTX毒副反應的關系，希望能找到更為安全、有效的個體化治療方案。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究選取2013年5月到2015年5月期間在我院接受診治的中危組和高危組ALL患兒46例，均為漢族，其中男20例，女26例，年齡1.0～12.2歲，平均(5.8±3.1)歲。排除經VDLD方案(長春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、地塞米松)誘導緩解、CAM方案(環磷酰胺、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤)早期強化治療后未達完全緩解、HDMTX化療前血常規和肝腎功、電解質、心肌酶學指標不正常者。所有對象的診療已征得監護人同意并簽署知情同意書，并通過我院醫學倫理委員會批準。診斷標準、危險度分型及治療方案均參照兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第四次修訂)[2]。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 對46例ALL患兒化療前抽取空腹靜脈血2ml，EDTA抗凝，使用柱提法進行DNA的提取，具體實驗步驟參考文獻[3]。

1.2.2 MTHFR(C677T)基因型檢測方法 采用PCR-芯片雜交法[上海百傲公司MTHFR(C677T)基因檢測試劑盒]檢測MTHFR(C677T)基因型。用于MTHFR677C/T擴增的上游引物為：5′-CCTTGAACAGGTGGAGGCC-3′；下游引物為5′-CAAAGAAAAGCTGCGTGATGAT-3′,擴增片段長158bp。PCR反應體系包括：Tris-HCl，KCl，MgCl2，dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，上下游引物，Taq酶、UNG酶，模板。PCR擴增程序為：(1)預變性94℃，5min；(2)35個循環，變性94℃ 25s；退火56℃ 25s；延伸72℃ 25s；(3)72℃延伸5min。取出擴增物，按照百傲雜交顯色試劑盒說明書要求進行雜交反應，反應結束后，應用生物芯片識讀儀進行圖像掃描。應用百傲MTHFR基因型分析軟件進行數據分析，把MTHFR劃分為CC野生型、CT雜合型、TT純合型。

1.2.3 化療方案 參照兒童ALL診療建議[2]，MTX的應用劑量，中危及高危組均為5.0g/m2，總量的1/10(不超過500mg)作為突擊量于30分鐘內快速靜脈滴入，余量于24小時內勻速滴入。突擊量MTX滴入后0.5～2小時，行三聯鞘內注射(MTX、阿糖胞苷，地塞米松)。使用突擊量42小時后，亞葉酸鈣予以解救，用量為15mg/ m2·次，q6h，首次為靜脈注射，以后為口服，共6～8次，直到MTX血藥濃度≤0.1μmol/L。HDMTX治療前、后3天口服碳酸氫鈉1.0g tid，并在治療當天給予5%碳酸氫鈉5ml/kg靜滴，保持尿pH≥7.0。用HDMTX當天及后3天需水化(4 000ml/m2·d)，并保護重要臟器如肝臟、腎臟功能，以及口腔黏膜、胃腸道等。在用HDMTX同時，每晚頓服6-巰基嘌呤50mg/m2，共7天。

1.2.4 毒副反應監測指標及評價 用藥前及用藥期間進行體格檢查、實驗室檢查(包括血常規、轉氨酶、膽紅素、血肌酐及尿素氮，每周3～4次)，并參照國立癌癥研究所常規毒性判定標準4.0版(NCI-CTC 4.0)對毒副反應進行評價分級。根據輕重程度將毒副反應劃分為4級，1級為輕度，2～4級為中重度。白細胞(3.0～3.9)×109/L為1級、(2.0～2.9)×109/L為2級、(1.0～1.9)×109/L為3級、<1.0×109/L為4級；血紅蛋白100～109 g/L為1級、80～99 g/L為2級、65～79 g/L為3級、﹤65 g/L為4級；血小板(75～99)×109/L為1級、(50～74.9)×109/L為2級、(25～49.9)×109/L為3級、﹤25×109/L為4級；轉氨酶1～2.5N(N=40U/L)為1級、2.6～5N為2級、5.1～10N為3級、>10N為4級；口腔粘膜損害無痛性潰瘍，紅斑或有輕度疼痛為1級、疼痛性紅斑水腫或潰瘍，但能進食為2級、疼痛性紅斑水腫或潰瘍，不能進食為3級、需胃腸外支持治療為4級；胃腸道反應以嘔吐為主要表現，1次/24h為1級、2～5次/24h為2級、6～10次/24h為3級、>10次/24h為4級。

1.2.5 MTX血藥濃度測定 自HDMTX開始后24、48小時各抽取2毫升靜脈血，送至我院藥劑科采用熒光偏振免疫法(FPIA)測定MTX血藥濃度。48小時MTX血藥濃度≥1μmol/L，為排泄延遲[4]。

1.3 統計學分析

使用SPSS 19.0軟件處理數據，使用χ2比較MTHFR各基因型的HDMTX化療毒副反應發生率的差異。采用Fisher′s精確概率法比較不同基因型48小時MTX血藥濃度的差異。P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MTHFR 677基因型的分布

采用PCR-芯片雜交法確定46例患兒MTHFR 677位點的基因型分別為TT純合型、CT雜合型、CC野生型。各基因型圖像掃描如圖1所示。其中CC野生型19例(41.3%)，CT雜合型16例(34.8%)，TT純合型11例(23.9%)。

圖1 MTHFR基因型掃描結果

2.2 毒副反應

HDMTX相關毒副反應主要表現為外周血白細胞減少(71.7%)、血紅蛋白減少(65.2%)、血小板減少(54.3%)、轉氨酶升高(37.0%)，毒性以2～4級為主，結果見表1。其他不良反應如口腔黏膜炎、胃腸道反應發生率較低。

表1 46例ALL患兒HDMTX相關毒副反應發生率[n(%)]

2.3 MTHFR基因型和HDMTX化療相關毒副反應的關系

MTHFR C677T各基因型與化療所致中重度(≥2級)毒副反應差異無統計學意義(P>0.05)，結果見表2，其他中重度毒副反應(口腔黏膜炎、胃腸道反應)發生率較低，故無法分析其與基因型的關系。

表2 MTHFR基因型和HDMTX毒副反應的關系[n(%)]

2.4 MTHFR基因型與48h MTX血藥濃度的關系

48小時 MTX血藥濃度≥1μmol/L的基因型分布頻率由高到低為TT型54.5%、CT型37.5%、CC型21.1%，提示MTHFR突變基因型(CT+TT)MTX有排泄延遲，但差異無統計學意義(P>0.05)，結果見表3。

表3 MTHFR基因型與48h MTX血藥濃度的關系[n(%)]

3 討 論

HDMTX在兒童ALL聯合化療方案中，對髓外白血病預防及持續緩解有著重要意義，但因其毒副反應發生率較高，限制了其在臨床中的使用，是阻礙患兒EFS進一步提高的重要原因之一。本研究參照《兒童急性淋巴白血病診療建議(第四次修訂)》的治療方案，將患兒分為低危組、中危組和高危組，并分別給予不同劑量的甲氨蝶呤進行化療。由于使用劑量直接影響化療毒副反應程度，因此本研究剔除了低危組數據，保留了使用同等劑量的中危組和高危組，共獲得46個病例。

HDMTX常見毒副反應為：(1)骨髓抑制；(2)肝腎功能損害；(3)胃腸道反應；(4)皮膚粘膜損害。其他如變態反應、腦白質損害相對較少。本研究毒副反應以骨髓抑制發生率最高，主要表現為外周血白細胞減少(71.7%)、血紅蛋白減少(65.2%)、血小板減少(54.3%)，毒性以2～4級為主，多數病例骨髓抑制出現在HDMTX后第4天，持續時間不超過10天，多數在下一療程前已經恢復，不影響下個療程進行。肝臟是MTX代謝和分解的主要場所，所以肝毒性的發生率也十分常見，本研究肝毒性主要表現為轉氨酶升高(37.0%)，未見黃疸、腹水、凝血功能異常等不良反應。肝毒性多出現于化療后第5天，多經過保肝治療后于10天左右恢復正常。此外，胃腸道反應占21.7%，主要表現為輕度惡心、嘔吐，可能與化療前常規預防性應用抗嘔吐藥及胃粘膜保護劑有關，且多在MTX結束后嘔吐緩解。MTX是S期抑制性藥物，由于消化道粘膜細胞增殖迅速，對MTX較為敏感，故易出現口腔、肛門、消化道粘膜損害，嚴重粘膜損害甚至可能致死。本研究中，口腔粘膜損害發生率較低，僅占10.9%，且以輕度為主，可能與注重水化、堿化，且常規預防性使用重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子含漱有關。本研究中無1例腎臟損害或嚴重致死性毒副作用發生。因此HDMTX期間，及時應用亞葉酸鈣解救，充分水化、堿化，并積極對癥、止吐、保護粘膜，多數患兒毒副作用程度較輕，經對癥處理后，多于1～2周恢復。

MTX是葉酸還原酶抑制劑，主要抑制二氫葉酸還原酶從而使二氫葉酸不能還原成有生理活性的四氫葉酸，從而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成過程中一碳基團的轉移作用受阻，導致DNA生物合成受到抑制。MTHFR作為葉酸代謝的限速酶，可催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，從而為體內嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白質的甲基化提供甲基。MTHFR基因突變頻率較高的位點是677C/T，發生C→T的堿基替代，造成蛋白質肽鏈中的第222位氨基酸發生變化，由GCC丙氨酸(Ala)變為GTC纈氨酸(Val)，導致MTHFR活性降低[5]。體外淋巴細胞酶活性顯示，MTHFR 677TT純合型與677CT雜合型二者的活性分別是677CC野生型的30%與60%[6]。這將會產生兩種生物學作用，一方面是MTX在細胞內對二氫葉酸向四氫葉酸的轉化產生抑制，造成細胞內的二氫葉酸及毒性代謝產物多聚谷氨酸蓄積，并且使得還原型葉酸減少，造成嘌呤與胸腺嘧啶合成障礙，對DNA復制產生抑制作用。另一方面，MTHFR基因突變后，活性降低也減少5-甲基四氫葉酸的利用，這就間接造成了患兒體內甲基化反應包括DNA、RNA和蛋白質甲基化的減低，導致DNA的修復能力及mRNA的穩定性下降。二者產生協同效應，造成MTHFR 677C→T突變患兒對MTX的敏感性增加，相關毒副反應增加以及MTX排泄延遲[7]。

本研究發現，C677T各基因型發生各類HDMTX化療毒副反應的差異無統計學意義。48小時 MTX血藥濃度≥1μmol/L的基因型分布頻率由高到低為TT型54.5%、CT型37.5%、CC型21.1%，提示MTHFR突變基因型(CT+TT)MTX有排泄延遲，但差異無統計學意義(P>0.05)，這與鄭苗苗等[8]及國外一些學者的研究結果一致[9-10]。而楊麗華[11]及Imanishi等[12]發現MTHFR C677T多態性與MTX排泄延遲、肝毒性均有相關性。Lopez[13]等報道MTHFR 677TT是MTX相關黏膜炎的高危因素。

眾多的研究結論之所以不同，原因可能有如下幾個方面：等位基因對于不同種族而言，存在頻率差異，再加上基礎疾病不同、血清葉酸水平以及飲食習慣、同時服用藥物不同等諸多的環境因素一起造成研究結果不同[14]。除了上述因素之外，造成研究結論不一樣的原因還可能與樣本量有限、MTX初始劑量不同、化療方案不同等相關。目前已有較多研究顯示，影響HDMTX化療毒副反應的因素，還可能有亞甲基四氫葉酸脫氫酶[15]、胸苷酸合酶[16]、還原型葉酸載體[16]、γ-谷氨酰水解酶[17]等基因多態性，它們可能相互協同、相互制約，最終造成毒副反應不一。

綜上所述，本研究認為MTHFR C677T基因多態性和HDMTX相關毒副反應間無相關性，故尚不能單獨作為HDMTX毒副反應的有效預測性指標。但因研究樣本例數偏少，后續研究將擴大樣本量繼續研究MTHFR 基因677位點和該基因更多的位點及其他與葉酸代謝相關基因與MTX藥物代謝和毒性反應的關系，期待大規模的樣本和更細致的研究方案來證實本實驗結果，為兒童ALL個體化治療提供更詳盡的理論依據。

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Association of Methylenetetrahydrofolatereductase Gene Polymorphism and Adverse Reaction of High Dose Methotrexate Treatment in Children with Acute Lymphoblastic Leukemia

Liao Jing, Li Ge, Zhang Rong

(DepartmentofPediatrics,SichuanProvincialPeople’sHospital,Chengdu610072,Sichuan,China)

Objective: To study the association between methylenetetrahydrofolatereductase (MTHFR) gene C677T polymorphism and toxicities after high-dose methotrexate (HD-MTX) infusion in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods: Peripheral blood samples of 46 children with ALL at complete remission stage accepting the treatment of HD-MTX were collected. Genomic DNA was extracted. Genotype of MTHFR was detected by PCR-chip hybridization technology. The plasma MTX concentration at 24h and 48h after the start of HDMTX was detected with fluorescence polarization immunoassay (FPIA). Toxicities of HDMTX were evaluated according to the National Cancer Institute-Common Toxicity Criteria (NCI-CTC). Results: Of all the cases who had HDMTX related toxicity, the incidence of hepatotoxity and myelosuppression were the highest. There was no evident relation between MTHFR-C677T and toxicity. Conclusion: Factors related with the metabolism and toxicity of MTX are complicated. The MTHFR gene 677 polymorphism may not serve as predictors of HDMTX related toxicity in children with ALL.

Methylenetetrahydrofolatereductase; Single Nucleotide Polymorphism; Acute Lymphoblastic Leukemia; Methotrexate; Adverse Reaction

2016- 02- 18

2016- 05- 26

廖 靜(1981-)，女，四川人，研究生，主治醫師，主要研究方向：兒童血液腫瘤。

R733.71; R730.53

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.03.003