視網膜神經節細胞凋亡對延遲整流鉀電流的影響*

趙 瑛， 徐亞吉， 路雪婧， 段俊國△

(1成都中醫藥大學視覺生理重點實驗室，四川 成都 610075； 2成都大學生理教研室，四川 成都 610106)

視網膜神經節細胞凋亡對延遲整流鉀電流的影響*

趙 瑛1， 徐亞吉2， 路雪婧1， 段俊國1△

(1成都中醫藥大學視覺生理重點實驗室，四川 成都 610075；2成都大學生理教研室，四川 成都 610106)

目的： 觀察視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡對延遲整流鉀電流(delayed recti-fier K+currents，IK)的影響。方法: 將原代培養2～3 d的SD乳大鼠RGCs分為對照組、加壓0.5 h組、加壓1 h組、加壓1.5 h組和加壓2 h組，對照組為常規培養6 d；其它各組常規培養6 d后用自行設計的加壓裝置加壓80 mmHg，時間分別為0.5 h、1 h、1.5 h和2 h，通過連續波長多功能微孔板檢測儀檢測各組RGCs線粒體的熒光強度；通過全細胞膜片鉗技術觀察各組細胞膜電容(membrane capacitance，Cm)的變化，觀察對照組與加壓1 h組IK、V1/2、k和Gmax的變化。結果: 對照組RGCs線粒體的熒光強度與加壓0.5 h組比較差異無統計學顯著性，而加壓1 h、1.5 h和2 h各組RGCs線粒體的熒光強度顯著低于對照組(P<0.05)；對照組RGCs的細胞Cm與加壓0.5 h組比較差異無統計學顯著性，其余各組RGCs的細胞Cm顯著低于對照組(P<0.05)。與對照組比較，加壓1 h能使電流幅度顯著增加，在刺激電位為-10 mV～60 mV時，加壓1 h組的電流密度明顯大于對照組(P<0.05)。加壓1 h組的Gmax值明顯高于對照組(P<0.05)，V1/2顯著小于對照組(P<0.01)，兩組間比較k值的差異無統計學顯著性。結論: 視網膜神經節細胞凋亡伴有IK通道電導增加，IK增大。

延遲整流鉀電流； 視網膜神經節細胞； 加壓； 細胞凋亡

青光眼是不可逆致盲性眼病，病理基礎是視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡，視野缺損，因此探索RGCs凋亡機理對預防和治療青光眼有重要意義。越來越多的研究表明，細胞內鉀離子濃度降低是多種細胞凋亡途徑的重要因素，胞內鉀外流是引起老年癡呆患者海馬神經元凋亡的關鍵[1]，隨著凋亡細胞內K+的丟失，細胞內促凋亡因子Bax表達增加使細胞凋亡[2]。我們前期的研究發現，青光眼大鼠的RGCs促凋亡因子Bax增加，凋亡抑制因子Bcl-2的表達減少，RGCs的凋亡增多[3]。然而尚不清楚在凋亡過程中RGCs的K+電流是如何變化的。為此，本研究探討壓力誘導RGCs凋亡時延遲整流鉀電流(delayed rectifier K+currents,IK)的變化，探索RGCs凋亡的機理，為防止青光眼視神經疾病奠定基礎。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及分組

SD乳鼠(出生2～3 d)，雌雄不拘，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供。將分離培養的乳鼠RGCs分為對照組、加壓0.5 h組、加壓1 h組、加壓1.5 h組和加壓2 h組。對照組為常規培養6 d；其余各組為常規培養6 d后用自行設計的加壓裝置加壓80 mmHg，時間分別為0.5 h、1 h、1.5 h和2 h。

2 主要試劑與儀器

多聚鳥氨酸、多聚賴氨酸、胰蛋白酶、ATP-Mg、 GTP、phosphocreatin、EGTA和Asp(Sigma)；層黏連蛋白(Roche)；胎牛血清、HEPES、 DMEM/F12、B-27、Thy1.1單克隆抗體、rhodamine 123和二甲基亞砜(Invitrogen)；羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物科技有限公司)；寧夏枸杞多糖(由香港大學腦與認知科學國家重點實驗室饋贈)。Multiclamp 700B膜片鉗系統(Axon)；P-97電極拉制儀(Sutter)；Ti倒置顯微鏡(Nikon)；DMi1倒置顯微成像系統(Leica)；SMZ445體視顯微鏡(Nikon)

3 方法

3.1 RGCs的培養 用文獻報道的方法[4]分離培養RGCs。取出生2～3 d內的SD乳鼠，75%乙醇消毒，斷頸處死，無菌條件下取眼球，置入含青霉素的PBS液中。在體視顯微鏡下沿角膜剪開，去除晶狀體和玻璃體，鈍性分離視網膜。將視網膜放入終濃度0.125%的胰蛋白酶中，吸管輕輕吹打，消化10 min，加入胎牛血清終止消化，用200目無菌鋼篩網過濾，濾液離心2次，1 000 r/min，每次10 min，棄上清液。向沉淀中加入DMEM/F12培養液(含90% DMEM/F12、10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，吸管吹打使之分散均勻制成單細胞懸液。將視網膜細胞懸液加入經羊抗鼠IgG和小鼠抗大鼠Thy-1.1單克隆抗體包被的培養皿中，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育30 min，使視網膜RGCs與Thy-1.1單克隆抗體充分結合。去除懸液，用無血清DMEM/F12培養液反復漂洗，清除培養皿表面未黏附細胞。用0.125%胰蛋白酶消化黏附的細胞5 min，小牛血清終止消化。收集細胞，1 000 r/min離心5 min，去上清，加入含胎牛血清的DMEM/F12培養液，用吸管反復吹打，使細胞分散均勻，制成細胞懸液，計數，將細胞懸液按每孔1×106個接種于經多聚鳥氨酸、層黏連蛋白包被的24孔板中，置于培養箱中培養。

3.2 線粒體膜電位的檢測 用0.125%胰蛋白酶消化黏附的細胞5 min，小牛血清終止消化，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，加入PBS液使細胞懸浮，將懸液加入酶標板中，靜置30 min貼壁，加入已配置好的1 μmol/L rhodamine 123，每孔20 μL，使終濃度至0.5 μmol/L，37 ℃孵育20 min，用PBS洗滌2次，用連續波長多功能微孔板檢測各組RGCs線粒體膜熒光強度，激發光波長為488 nm，發射光波長為532 nm，重復3次實驗。

3.3 全細胞膜片鉗記錄 在室溫條件(20～25 ℃)下記錄各組RGCs的膜電容(membrane capacitance,Cm)以及對照組與加壓1 h組的IK。采樣頻率為10 kHz，低通濾波頻率2 kHz，保持電位鉗制在-50 mV，以10 mV的階躍，從-50 mV去極化至+60 mv，鉗制時間為200 ms。電極液(mmol/L)：KOH 110、KCl 20、Asp 110、MgCl21、HEPES 10、EGTA 5、ATP-Mg 5、GTP 0.1、phosphocreatin 5，用KOH調節pH值至7.2；細胞浴液(mmol/L)：NaCl 136、KCl 5.4、CaCl21.0、MgCl21.0、NaH2PO40.33、HEPES 5、glucose 10、CoCl23，用NaOH調節pH值至7.35。

4 統計學處理

采用Clampfit 10.0和Origin 7.5軟件進行數據處理并作圖，采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間進行比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 加壓對RGCs線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位與rhodamine 123熒光強度成正比，因此可通過rhodamine 123熒光強度間接觀察線粒體膜電位的變化。對照組與加壓0.5 h組比較差異無統計學顯著性，加壓1 h組、加壓1.5 h組和加壓2 h組顯著低于對照組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.Time courses of pressure-induced decreses in rhodamine 123 fluorescence in the mitochondria of RGCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 加壓時間延長引起RGCs線粒體膜電位減小

2 加壓對細胞Cm的影響

為了觀察加壓誘導凋亡細胞體積的變化，我們在電生理實驗中觀察了加壓不同時間的細胞Cm，對照組和加壓0.5 h組細胞的Cm差異無統計學顯著性，加壓1 h、1.5 h和2 h組細胞的Cm均顯著低于對照組(P<0.05)，而加壓1.5 h和2 h組細胞的Cm差異無統計學顯著性，見圖2。

3 凋亡的RGCsIK的改變

加壓80 mmHg 1 h能使RGCs發生凋亡，因此，本研究采用全細胞電壓鉗制脈沖刺激模式記錄對照組和加壓1 h組RGCs 的IK。選擇胞體光澤好、細胞膜光滑、立體感強的細胞進行實驗。與對照組比較，加壓1 h能使電流幅度顯著增加。各階躍電壓下的電流大小以電流密度(電流/膜電容)表示，做電流-電壓(I-V)曲線，與對照組比較，在刺激電位為-10 mV～60 mV時，加壓組的電流密度明顯大于對照組，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.Time courses of pressure-induced decreses in the membrane capacitance. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group.

圖2 加壓時間延長引起細胞膜電容減小

4 凋亡的RGCsIK的動力學改變

從IK電流-電壓曲線中獲得數據并轉化為電導值，以標準化電導值對膜電位作圖，用Boltzmann方程G=Gmax/{1+exp[(V1/2-Vm)/k]}擬合，得到最大電導值(Gmax)、IK電流激活曲線、IK半數激活電壓(V1/2)和斜率k值。加壓1 h組的Gmax與對照組的Gmax比較差異有統計學顯著性(P<0.05)，加壓1 h組的V1/2與對照組比較差異有統計學顯著性(P<0.01)；兩組比較k值間的差異無統計學顯著性，見圖4、表1。

討 論

青光眼是全世界第二位致盲性眼病，據流行病學調查顯示，目前，我國40歲以上人群中，青光眼患者達到2 210萬人，且青光眼患者數量呈逐年上升的趨勢[5]，青光眼的主要病理變化是視網膜神經節細胞的凋亡及視神經的永久性損害，視野缺損，因此，探索青光眼視網膜神經節細胞凋亡的機制尤為重要。

細胞凋亡是細胞死亡的主要形式之一，誘導凋亡的方法根據研究者們研究的對象和目的而采取不同的方法，國內外研究己證實外來機械壓力可導致淋巴細胞凋亡[6]，神經節細胞的損傷或凋亡[7-8]。本實驗室早已建立了成熟的加壓誘導RGCs細胞凋亡的方法，發現加壓80 mmHg 1 h能誘發RGCs凋亡[9]，采用加壓的方法誘導RGCs凋亡模擬了眼球在高壓狀態下引起RGCs凋亡及損傷的情況。

線粒體在細胞凋亡過程中發揮積極主動的調控作用，而且處于多種凋亡調控通路和信號的中心地位[10]。正常的線粒體膜電位是生存所必須的，當細胞受到凋亡誘導因素作用后，線粒體膜受到破壞使其膜電位降低，導致線粒體內促凋亡蛋白分子釋放，使細胞凋亡。Rhodamine 123是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑，rhodamine 123熒光與線粒體膜電位呈線性關系。我們的研究顯示隨著加壓時間大于1 h，rhodamine 123熒光強度降低，該研究結果與凋亡的大腦紋狀體神經細胞內rhodamine 123顆粒熒光強度降低[11]，缺氧誘導的大鼠皮層神經細胞線粒體膜電位降低一致[12]。熒光強度的降低可能與加壓引起RGCs線粒體膜完整性破壞有關，從線粒體中釋放出活性氧(reactive oxygen species,ROS)、caspase-3、caspase-9等促凋亡蛋白[13-14]可能引起壓力誘導的RGCs凋亡。我們的研究還發現，加壓80 mmHg 1 h、1.5 h、2 h會引起RGCs的Cm變小，而加壓1.5 h 與加壓2 h無明顯的差異，細胞Cm間接反映了細胞體積的大小，這與細胞凋亡時細胞體積變小的基本形態學特性一致。我們的這些研究結果也再次證明了加壓 80 mmHg 1 h可引起RGCs凋亡。

Figure 3.The delayed rectifier K+currents in control group and pressure 1 h group. A: voltage clamp protocol, voltage step from -50 to 60 mV; B: current traces ofIKin control group and pressure 1 h group; C: current (I)-voltage (V) relationship of the 2 groups. Mean±SD.n=9.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 加壓1 h組與對照組IK的變化

Figure 4.The conductance-voltage curves for control and pressure 1 h groups. Mean±SD.n=9.

圖4 加壓1 h組和對照組的電導-電壓曲線

表1 兩組IK的動力學特征

*P<0.01,**P<0.05vscontrol group.

大量的研究發現，多種細胞凋亡伴有細胞內鉀離子的外流增加，本研究發現加壓引起細胞IK增大，V1/2左移變小，Gmax增加，這一研究結果與文獻報道的神經細胞凋亡時外向鉀電流增加[15]一致，說明RGCs凋亡也伴有外向鉀電流增加，增加的原因可能是細胞膜上的K+通道數開放增多，電導增大，但并不能說明通道開放的速度增快。此外，外向鉀電流的增加，細胞內容物減少，促進了細胞體積變小，這也可能是細胞凋亡時體積變小的原因。然而，RGCs凋亡時外向鉀電流增加是否是RGCs凋亡的必要條件，鉀通道在RGCs凋亡過程中的作用是什么?哪種類型的鉀通道參與RGCs凋亡我們還要做進一步的研究。

致謝: 感謝蘇國輝院士為本研究提供寧夏枸杞多糖。

[1] 金宏偉. 電壓依賴性鉀通道在老年癡呆相關的神經細胞凋亡中的作用研究 [D].北京：中國協和醫科大學，1999．

[2] 楊巧云．鉀離子調節轉錄因子活性參與神經元凋亡機制的探討[D]．上海：中國科學院上海生命科學研究院神經科學研究所，2006．

[3] 趙 瑛，劉立夏，黃 燕，等．枸杞多糖對高眼壓大鼠視網膜神經節細胞的影響[J]. 中醫眼耳鼻喉雜志, 2012, 2(1):24-26．

[4] 張 虹，鐘 杰，李貴剛，等．壓力對大鼠純化視網膜神經節細胞存活及軸突生長的影響[J]. 中華眼科雜志, 2009, 44(2):164-167.

[5] Jonas JB, George R, Asokan R, et al. Prevalence and causes of vision loss in Central and South Asia: 1990-2010 [J]. Br J Ophthalmol, 2014, 98(5):592-598.

[6] Takano KJ, Takano T, Yamanouchi Y, et al. Pressure-induced apoptosis in human lymphoblasts[J]. Exp Cell Res, 1997, 235(1):155-160.

[7] Chen C, Wang L, Rong X, et al. Effects of fluoxetine on protein expression of potassium ion channels in the brain of chronic mild stress rats[J]. Acta Pharm Sin B, 2015, 5(1):55-61.

[8] Pannaccione A, Boscia F, Scorziello A, et al. Up-regulation and increased activity of KV3.4 channels and their accessory subunit MinK-related peptide 2 induced by amyloid peptide are involved in apoptotic neuronal death[J]. Mol Pharmacol, 2007, 72(3):665-673.

[9] 曾潔萍. DSX及其成分對體外培養鼠視網膜神經節細胞影響的實驗研究[D]. 成都：成都中醫藥大學，2003．

[10]Susin SA, Zamzami N, Kroemer G.Mitochondria as regulators of apoptosis: doubt no more[J]. Biochim Biophys Acta, 1998, 1366(1-2):151-165.

[11]Tang K, Zhang JT. Clausenamide improves long-term potentiation impairment and attenuates apoptosis after tran-sient middle cerebral artery occlusion in rats[J]. Neurol Res, 2003, 25(7):713-717.

[12] 魏楚蓉，劉路寬，田立兵，等．硫化氫對缺氧誘導的大鼠皮層神經元損傷的保護作用[J].中國病理生理雜志，2014,30(2):203-207.

[13]應 俊，潘若望，王茂峰，等.藻藍蛋白誘導喉癌HEP-2細胞凋亡的實驗研究[J].中國病理生理雜志，2015,31(7):1189-1196.

[14]劉 俊，張雪林，任永生，等．BARF1表達下調通過活化caspase依賴的線粒體通路誘導EBV陽性胃癌細胞凋亡[J].中國病理生理雜志，2015,31 (11):1970-1978.

[15]Norris CA, He K, Springer MG, et al. Regulation of neuronal proapoptotic potassium currents by the hepatitis C virus nonstructural protein 5A[J]. J Neurosci, 2012, 32(26):8865-8870.

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of retinal ganglion cell apoptosis on delayed rectifier K+currents

ZHAO Ying1, XU Ya-ji2, LU Xue-jing1, DUAN Jun-guo1

(1KeyLaboratoryforVisionPhysiology,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610075,China;2DepartmentofPhysiology,ChengduUniversity,Chengdu610106,China.E-mail:duanjgs@126.com)

AIM: To investigate the effects of rat retinal ganglion cell (RGC) apoptosis on delayed rectifier K+currents (IK). METHODS: The retinas of 2～3 d newborn Sprague-Dawley rats were dissociated into cell suspension by trypsin digestion. The RGCs were cultured and divided into control group, pressure 0.5 h group, pressure 1 h group, pressure 1.5 h group and pressure 2 h group. The cells were cultured regularly for 6 d in control group, and the cells in other groups were cultured regularly for 6 d and gave pressure of 80 mmHg for 0.5 h, 1 h, 1.5 h and 2 h, respectively. The rhodamine 123 fluorescence from labeled RGC mitochondrion was detected by continuous wavelength multifunctional microplate detection instrument. The membrane capacitance (Cm) in different groups andIKin the pressure 1 h group were recorded from the RGCs by whole-cell patch-clamp technique. RESULTS: No difference of rhodamine 123 fluorescence in the RGC mitochondria between control group and pressure 0.5 h group was observed. Rhodamine 123 fluorescence in the other 3 groups was significantly lower than that in control group (P<0.05). No difference of theCmbetween control group and pressure 0.5 h group was found, and theCmin the other 3 groups was significantly lower than that in control group (P<0.05). The amplitudes ofIKwere higher than that in control group. At the test potential from -10 mV to 60 mV, the current density in pressure 1 h group was significantly higher than that in control group (P<0.05). The maximal conduction (Gmax) in pressure 1 h group was significantly higher than that in control group. The voltage forIKchannel half-activation (V1/2) in pressure 1 h group declined comparison with control group (P<0.01), and thekvalue had no significant difference between the 2 groups. CONCLUSION: Retinal ganglion cell apoptosis accompanies with delayed rectifier K+current enhancement.

Delayed rectifier K+currents; Retinal ganglion cells; Pressure; Apoptosis

1000- 4718(2016)08- 1403- 05

2016- 02- 26

2016- 06- 15

國家科技部重大新藥創制資助項目(No. 2009ZX09103-369)；四川省教育廳重點項目(No. 200ZD013)

R774.6；R339.14

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.010

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 028-87715032; E-mail： duanjgs@126.com