C1型尼曼-匹克氏癥小鼠的腎臟功能及病理變化*

劉彥禮， 喬 梁， 張金珠， 楊 芬， 閆 巖， 閆 欣△， 林俊堂△

(1新鄉醫學院生命科學技術學院, 2河南省醫用組織再生重點實驗室， 河南 新鄉 453003)

C1型尼曼-匹克氏癥小鼠的腎臟功能及病理變化*

劉彥禮1, 2， 喬 梁1, 2， 張金珠1， 楊 芬1， 閆 巖2， 閆 欣1△， 林俊堂1, 2△

(1新鄉醫學院生命科學技術學院,2河南省醫用組織再生重點實驗室， 河南 新鄉 453003)

目的： 探討Npc1基因突變小鼠腎臟功能及病理生理的變化，為C1型尼曼-匹克氏癥(NPC1)患者臨床上藥物的使用及腎功能的維持提供理論依據。方法: 用PCR法確定小鼠基因型；選取出生后第60天(P60)的野生型NCPC1(Npc1+/+)和突變型NCPC1(Npc1-/-)小鼠，檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性及尿素(Urea)、尿酸(UA)和肌酐(Cr)的含量來評價Npc1-/-小鼠的肝腎功能變化；進一步常規冷凍切片后通過β-半乳糖苷酶染色及Masson染色來分別評價Npc1-/-小鼠腎臟衰老及纖維化情況。結果: 與P60的Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠的體重和腎臟重量顯著降低(P<0.01)；肝腎功能明顯減退：ALT、AST及LDH活性顯著升高(P<0.05)，Urea、UA及Cr的含量顯著增加(P<0.05)；冷凍切片染色結果表明腎臟組織衰老明顯(P<0.01)，纖維化程度顯著增強(P<0.01)。結論:Npc1基因突變導致的脂質異常代謝可加速腎間質纖維化，促使腎臟衰老，最終導致腎功能減退。

C1型尼曼-匹克氏癥； 腎臟； 纖維化；Npc1基因

作為一種罕見的致死性常染色體隱性遺傳疾病，C1型尼曼-匹克氏癥(Niemann-Pick disease type C1，NPC1)是由Npc1基因突變引起的神經系統及機體內臟脂類代謝異常疾病[1-2]。該病多發于幼兒，少數在中青年發病，新生兒患病率約為1/120 000，患者多在發病后的5～20年內死亡。NPC1患者臨床初期表現為肝脾腫大，后期主要表現為進行性神經系統受損，如共濟失調、肌張力障礙、癡呆和癲癇等，其主要原因是Npc1蛋白結構發生變化，導致細胞內脂類運輸障礙，引起細胞內脂質體中未酯化的膽固醇、鞘糖脂等沉積，進而促使細胞變性死亡[3-5]。目前，國內外尚缺乏有效的治療手段，主要以對癥治療、預防和支持治療為主，最大限度延長患者壽命，改善患者生活質量。

前期研究已表明Npc1基因自發突變所產生的Npc1-/-小鼠(BALB/cNctr-Npc1m1N/J)臨床表型及相關病理學變化與人類NPC1神經病變相似，是研究NPC1的理想動物模型[6]。目前，NPC1的研究多集中于神經系統病變，而對機體其它臟器病理變化研究較少[2-3, 5]。因此，本實驗將以Npc1-/-小鼠為對象，研究其晚期腎臟的病理變化，探討Npc1基因突變對腎臟影響的潛在機制，進一步為臨床上改善患者生活質量和延長壽命提供支持。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

Npc1+/-小鼠由浙江大學段樹民院士提供；6～8周SPF級BABL/c小鼠，體重(24±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號SCXK(京)2012-0001]。所有實驗動物飼養于室溫(22±1)℃，濕度控制在40%～70%，12 h/12 h明暗交替。飼料、墊料和飲水均經過高溫高壓滅菌處理后使用；實行自由采食和飲水，墊料1周更換2次。

2 主要試劑

鼠尾基因組DNA提取試劑盒及PCR相關試劑(康為世紀生物科技有限公司)；β-半乳糖苷酶染色試劑盒及封片液(碧云天生物技術有限公司)；Masson染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

3 主要方法

3.1Npc1-/-小鼠的獲得及鑒定 2月齡雌性BABL/c小鼠與雄性雜合子(Npc1+/-)小鼠按照2∶1配對合籠，交配后獲得野生型(+/+)、雜合型(+/-)和突變型(-/-)子鼠。子鼠于3周左右斷奶，根據性別分籠。基因型鑒定程序如下：鼠尾基因組DNA提取后，分別采用圖1A所示引物對Npc1+/+和Npc1-/-小鼠進行基因型鑒定，具體PCR反應條件為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,63 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 2 min。PCR擴增產物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。判斷標準為：野生型(Npc1+/+)173 bp；雜合型(Npc1+/-)173 bp和475 bp；突變型(Npc1-/-)475 bp。

3.2 血清中肝腎功能相關指標的檢測 取出生后第60天(postnatal day 60，P60)的Npc1-/-和Npc1+/+小鼠各5只，稱重后采用摘眼球法收集血液約0.6 mL于促凝管中，立即送至新鄉醫學院第三方醫學檢驗中心進行相關指標檢測。其中血清中丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性通過速率法檢測；血清中尿素(urea)、尿酸(uric acid，UA)及肌酐(creatinine，Cr)含量分別通過脫氫酶法、尿素酶法及氧化酶法進行測定。

Figure 1.The results of mouse genotype identification. A: the primers used to identify different genotypes of NPC1 mice; B: PCR results of three genotypes for NPC1 mice after electrophoresis.Npc1+/+: wild type;Npc1+/-: heterozygote;Npc1-/-: mutant.

圖1 野生型與突變型小鼠鑒定所需引物及結果

3.3 組織取材及切片 將上述采血后小鼠快速打開腹腔，摘取腎臟稱重后轉移至4 ℃預冷處理的PBS液漂洗3次，置于4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)中，4 ℃搖床過夜；取出組織吸干液體，經15%和30%蔗糖溶液梯度過夜脫水，待組織沉淀到管底部時取出吸干液體；用錫箔紙做一直徑為1 cm的柱狀模型，加入適量OCT包埋劑，使腎臟豎立，確定腎臟位于柱狀模型的正中央，置于液氮中冷凍后放-80 ℃冰箱保存；切片時取出已包埋的組織在冷凍切片機上固定，厚度20 μm切片后，于烤片機上37 ℃烤片30 min以上。

3.4 β-半乳糖苷酶染色 將冰凍切片于室溫下固定30 min(β-半乳糖苷酶染色固定液)，PBS漂洗3次，每次5 min；棄去PBS后加入適量染色工作液(按試劑盒說明配制)，置于濕盒內37 ℃孵育過夜；封片后于體式顯微鏡及普通光學顯微鏡下觀察；每種基因型(Npc1-/-和Npc1+/+)至少檢測3只小鼠。隨后，將原始圖片轉換成黑白圖片，應用Motic Images Advanced 3.2軟件進行灰度值掃描并量化。

3.5 Masson染色 將冰凍切片于室溫下用4%PFA固定15 min，PBS漂洗3次；核染液染色60 s，沖洗液沖洗30 s；漿染液染色60 s，沖洗液沖洗30 s；分色液分色10 min后，復染液染色1 min；無水乙醇沖洗，封片后于體式顯微鏡及普通光學顯微鏡下觀察，并對由膠原纖維沉積形成的斑塊進行量化；每種基因型(Npc1-/-和Npc1+/+)至少檢測3只小鼠。

4 統計學處理

所有檢測數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0軟件完成統計，采用Student’st檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1Npc1-/-小鼠的鑒定

提取新生小鼠尾部DNA，利用野生型和突變型引物進行PCR擴增的結果如圖1B所示。Npc1+/-小鼠可擴增出大小分別為475 bp和173 bp的2條目的條帶；Npc1+/+小鼠僅能擴增出1條173 bp的條帶；而Npc1-/-小鼠僅能擴增出1條475 bp的條帶。

2 晚期Npc1-/-小鼠腎臟重量及肝腎功能的檢測

Npc1-/-小鼠腎臟重量檢測結果如圖2所示，與Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠無論在體重及腎臟重量上均顯著減少(P<0.01)。進一步通過檢測血清中與肝臟及腎臟相關的關鍵酶活性及活性物質的含量變化來評價晚期Npc1-/-小鼠肝腎功能，結果如表1所示：與Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠血清中urea、Cr及UA含量均顯著升高(P<0.05)，同時LDH、 ALT及AST的活性也有顯著升高(P<0.05)。

Figure 2.The body weight and kidney weight ofNpc1+/+andNpc1-/-mice at P60. Mean±SD.n=22.**P<0.01vsNpc1+/+mice.

圖2 P60Npc1+/+與Npc1-/-小鼠體重及腎臟重量比較

3 晚期Npc1-/-小鼠腎臟組織衰老的檢測

Npc1+/+與Npc1-/-小鼠的β-半乳糖苷酶染色陽性(靛藍色)細胞均定位在腎皮質，髓質中鮮有表達；與Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠腎臟的β-半乳糖苷酶染色陽性區域靛藍色程度明顯增加，且大部分腎小管出現彌漫性陽性染色；隨后，將原始圖片轉換成黑白圖片，灰度值掃描結果顯示Npc1+/+與Npc1-/-小鼠的β-半乳糖苷酶染色陽性區域著色程度具有顯著差異(P<0.01),見圖3。

表1 肝腎功能相關指標的檢測結果

Table 1.The activity of key enzymes and content of urea, UA and Cr in the serum ofNpc1+/+ andNpc1-/- mice at P60 (Mean±SD.n=5)

IndexesNpc1+/+Npc1-/-Urea(mmol/L)7.00±0.3011.53±1.31*Cr(μmol/L)11.33±0.5816.67±2.43*UA(μmol/L)102.00±20.81302.33±47.07**LDH(U/L)789.67±276.512014.33±560.42*ALT(U/L)37.33±9.54560.67±41.31**AST(U/L)128.67±27.54983.67±36.85**

Cr: creatinine; UA: uric acid; LDH: lactate dehydrogenase; ALT: alanine aminotranferase; AST: aspartate aminotranferase.*P<0.05,**P<0.01vsNpc1+/+mice.

Figure 3.Senescence-associated β-galactosidase staining in renal tissues ofNpc1+/+andNpc1-/-mice at P60. A: the images of β-galactosidase staining in renal tissues ofNpc1+/+andNpc1-/-mice under microscope; B: quantification of the color value in the transformed monochrome images. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNpc1-/-mice.

圖3 P60Npc1+/+與Npc1-/-小鼠腎臟組織β-半乳糖苷酶衰老染色結果

4 晚期Npc1-/-小鼠腎臟組織纖維化的檢測

Npc1-/-小鼠腎臟Masson染色纖維化部位(圖中黑色箭頭所指藍色部位)主要定位于腎小管間質，可見大量膠原沉積，成條索狀或小片狀分布，著色深；而Npc1+/+小鼠腎臟Masson染色后未見明顯膠原沉積形成；量化結果表明二者在由膠原沉積產生的斑塊數量上具有顯著性差異(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.Masson staining for renal fibrosis inNpc1+/+andNpc1-/-mice at P60 (the collagen plaques are indicated by black arrows). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNpc1-/-mice.

圖4 P60Npc1+/+與Npc1-/-小鼠腎臟組織Masson染色結果

討 論

NPC1作為一種典型的神經退行性疾病，是由Npc1基因突變所引起的，其所編碼的蛋白是由1 278個氨基酸殘基組成的細胞膜蛋白分子，可直接結合膽固醇后將其從脂質體轉運到質膜和內質網，從而調節細胞內脂質代謝平衡[7-9]。該病多發于幼兒，少數在中青年發病，由于NPC病因的不可逆性，國內外目前尚缺乏有效的治療手段，主要以預防性和支持性治療為主，最大限度延長患者壽命，改善患者生活質量。

前期研究發現，NPC1患者神經組織中存在大量異常膽固醇、鞘磷脂及糖脂的沉積，其主要病理特征為神經軸突營養不良伴有球狀軸突形成、神經元變性以及進行性脫髓鞘；進一步的研究表明，NPC1患者海馬等腦區存在大量的神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)，除異常磷酸化的tau蛋白外，還發現NFT或球狀軸突內聚集了大量高度磷酸化的細胞骨架蛋白[10-12]。近年來，針對該疾病經典動物模型Npc1-/-小鼠的深入研究發現，該小鼠的丘腦-皮質系統在出生后3周左右即出現大量阿米巴樣的小膠質細胞，其活性隨著病情的發展逐漸增強，而大腦的不同部位超磷酸化神經細絲表達量也隨著病情發展顯著增加，產生大量的NFT，導致神經元變性或死亡，引起海馬、丘腦、小腦和脊髓等多處神經組織發生病理性變化[13-15]。

目前，針對NPC1的研究多集中于神經及肝脾組織，對腎臟組織在疾病發展中的病理變化鮮有報道，僅明確在患者腎臟組織中存在典型的泡沫樣細胞[1, 4]。而腎臟作為機體內容易受損、衰老的重要臟器，其功能運轉情況深切影響患者生活質量及壽命。因此，本研究首先針對晚期(P60)Npc1-/-小鼠腎功能指標檢測發現，與Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠腎臟重量不僅顯著降低，而且功能減退明顯。基于上述實驗數據及已明確的Npc1基因突變會引起神經細胞過早凋亡等事實，我們推測Npc1基因突變亦會引起腎臟組織過早衰老，隨后的β-半乳糖苷酶衰老染色結果也證實了Npc1-/-小鼠腎臟衰老程度要顯著高于Npc1+/+小鼠；而進一步纖維化染色結果證明了Npc1-/-小鼠腎臟的衰老快速可能與其腎間質纖維化有關。

綜上所述，本研究初步闡明了Npc1基因突變引起的脂質代謝異常可加速腎間質纖維化，促使腎臟衰老，最終導致患者腎功能減退。該結果可為NPC1患者臨床上藥物的使用及腎臟功能的維持提供借鑒，以期最大限度地改善患者生活質量及延長壽命。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

記憶提取過程中杏仁核積極和消極信息的不同路徑

眾所周知，基底外側杏仁核(basolateral amygdala, BLA)在積極和消極記憶信息的形成中發揮著至關重要的作用，但我們對于其相關信息的編碼和路徑知之甚少。Beyeler等記錄了在相關記憶提取過程中BLA神經元的變化，并使用光遺傳學介導的光學示蹤技術來鑒定連接BLA與伏隔核(nucleus accumbens, NAC)、中央杏仁核(central amygdala, CEA)或腹側海馬回(ventral hippocampus, vHPC)的神經元群的數量。研究發現，盡管每個群內都發生了不同的神經反應，但被獎勵預測回路興奮的BLA-NAc神經元和被厭惡預測回路興奮的BLA-CeA神經元數量均多于整個BLA。雖然已知BLA-vHPC投射回路可驅動先天性消極行為，但這些神經元并不傾向于編碼習得性消極行為。總之，這些研究結果表明，在BLA，兩價信息的編碼至少部分經由解剖學意義上的神經元群的不同活動所介導。

Neuron, 2016, 90(2):348-361(范沖竹)

Renal function and pathological changes in Niemann-Pick disease type C1 mice

LIU Yan-li1, 2, QIAO Liang1, 2, ZHANG Jin-zhu1, YANG Fen1, YAN Yan2, YAN Xin1, LIN Jun-tang1, 2

(1CollegeofLifeScienceandTechnology,XinxiangMedicalUniversity,2HenanKeyLaboratoryofMedicalTissueRegeneration,Xinxiang453003,China.E-mail:pangyufu@aliyun.com;linjtlin@126.com)

AIM: To investigate the renal function and pathological changes inNpc1 mutant (Npc1-/-) mice. METHODS: Different genotypes of Niemann-Pick disease type C1 (Npc1) mice were identified by PCR. Subsequently, the renal function ofNpc1-/-andNpc1+/+mice at postnatal day 60 (P60) was evaluated by measuring the activity and content of important indicators in the serum including ALT, AST, LDH, urea, UA and Cr. Furthermore, β-galactosidase staining and Masson staining were performed to examine the aging and fibrosis of the renal tissues, respectively. RESULTS: Compared with theNpc1+/+mice, the body weight and kidney weight had a significant reduction (P<0.01) in theNpc1-/-mice. The results of hepatic and renal functions showed that the activities of ALT, AST and LDH, and contents of urea, UA and Cr had marked increases (P<0.05) in theNpc1-/-mice. Moreover, the results of senescence-associated β-galactosidase staining in the renal tissues demonstrated accelerated aging in theNpc1-/-mice (P<0.01), and these results were confirmed by Masson staining, which clearly showed the formation of collagen fibers (P<0.01).CONCLUSION: Mutation of theNpc1 gene results in abnormal lipid metabolism, which accelerates kidney senescence by promoting fibrosis in the renal tissue and subsequently causes reduction in renal function.

Niemann-Pick disease type C1; Kidney; Fibrosis;Npc1 gene

1000- 4718(2016)08- 1435- 05

2015- 12- 31

2016- 03- 10

國家自然科學基金資助項目(No. 81400936)；國家自然科學基金-河南人才培養聯合基金資助項目(No. U1304808)；河南省高等學校重點科研項目計劃(No. 15A180009)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.016

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