威靈仙多糖對實驗性非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清RBP4水平和胰島素抵抗指數的干預作用

胡敏敏，王 偉，畢洪鐘，潘 金，琚 堅

昆明醫科大學第二附屬醫院特需病房，云南 昆明 650101

威靈仙多糖對實驗性非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清RBP4水平和胰島素抵抗指數的干預作用

胡敏敏，王 偉，畢洪鐘，潘 金，琚 堅

昆明醫科大學第二附屬醫院特需病房，云南 昆明 650101

目的 研究威靈仙多糖對非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)大鼠胰島素抵抗的干預作用，及實驗性NASH大鼠血清視黃醇結合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)與胰島素抵抗的相關性。方法 建模階段：50只清潔級健康雄性SD大鼠隨機分為空白組(n=14)和造模組(n=36)?？瞻捉M用普通飼料飼養；造模組用高脂飼料飼養，建立NASH大鼠模型。干預階段：將造模組大鼠(n=30)隨機分為模型組、易善復組和威靈仙多糖組，每組各10只；空白組大鼠(n=8)作為對照組，依次分別給予0.9% NS、易善復溶液、威靈仙多糖溶液、0.9% NS灌胃干預，8周后4組大鼠下腔靜脈取血檢測空腹血糖、空腹胰島素及RBP4的含量，統計分析各組上述指標的差異及胰島素抵抗指數(HOMA-IR)與RBP4的相關性。結果 與模型組相比，威靈仙多糖組NASH大鼠HOMA-IR、血清RBP4水平較低(P<0.05)；NASH大鼠HOMA-IR與血清RBP4呈正相關(r=0.541，P=0.001)。結論 威靈仙多糖可有效治療NASH大鼠，其主要機制之一可能是通過降低NASH大鼠血清RBP4水平，改善NASH大鼠胰島素抵抗。

非酒精性脂肪性肝炎；視黃醇結合蛋白4；威靈仙多糖

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征，其病程包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化，最終可能演變為肝硬化或肝癌[1]。視黃醇結合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)是視黃醇結合蛋白家族中的一員[2]，近年來發現RBP4是一種新的脂肪因子[3]，血清RBP4分泌增加與肝脂肪變及肝臟損傷有關，RBP4可能是NAFLD的獨立相關因素[4]。

本研究旨在探討威靈仙多糖對非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)大鼠胰島素抵抗的干預作用，及NASH大鼠血清RBP4水平與胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康雄性SD大鼠50只，平均體質量(70±10)g，購自昆明醫科大學動物實驗中心；豬油購自昆明市農貿市場；蛋黃粉、膽固醇、膽酸鈉購自上海源葉生物科技有限公司；威靈仙多糖購自安徽大學生命科學院；易善復(多烯磷脂酰膽堿)購自賽諾菲(北京)制藥有限公司；戊巴比妥鈉購自上海西塘生物科技有限公司；甲醛購自上海遠慕生物科技有限公司。

1.2 試劑 大鼠RBP4 ELISA試劑盒購自LSBio公司；大鼠胰島素ELISA試劑盒購自ALPCO公司。

1.3 方法

1.3.1 造模階段實驗動物分組：將50只清潔級健康雄性SD大鼠隨機分為空白組(n=14)和造模組(n=36)。

1.3.2 NASH大鼠模型的建立：空白組予普通飼料喂養16周；造模組予高脂飼料(飼料配比：82.5%普通飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉)喂養16周。在造模期間第4周末隨機選擇空白組和模型組大鼠各1只、第8周末各1只、第12周末各2只、第16周末各2只，下腔靜脈取血測定空腹血糖、空腹胰島素值，根據血糖及空腹胰島素值計算HOMA-IR；于肝右葉中央部位取適量肝組織，行HE染色后在光鏡下觀察肝臟脂肪變、炎癥情況，統計分析空白組和模型組大鼠血清中空腹血糖、空腹胰島素含量的差異，最后根據檢測及觀察的相關指標來判斷實驗性NASH大鼠模型是否成功建立。

1.3.3 藥物干預階段實驗動物分組：實驗性NASH大鼠模型成功建立后，將余下的30只造模組大鼠隨機分為模型組、易善復組和威靈仙多糖組，每組各10只；余下的8只空白組大鼠作為對照組。

1.3.4 藥物干預：模型組、易善復組、威靈仙多糖組、對照組依次分別予0.9% NS、易善復[195.4 mg·kg-1·d-1]、威靈仙多糖[50 mg·kg-1·d-1]、0.9% NS配成3 ml溶液，灌胃干預8周。

1.3.5 大鼠血清采集：剖殺大鼠前禁食禁飲24 h，3%戊巴比妥鈉(0.1～0.15) ml/100 g行腹腔麻醉，然后下腔靜脈采血測定空腹胰島素、空腹血糖、血清RBP4水平。

1.3.6 大鼠血清指標測定：空腹血糖采用全自動生化儀檢測；空腹胰島素測定步驟嚴格按照大鼠胰島素ELISA試劑盒說明書進行操作；血清RBP4測定步驟嚴格按照大鼠血清RBP4 ELISA試劑盒說明書進行操作。HOMA-IR=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mIU/L)/22.5。

1.3.7 肝臟病理結果判定：肝組織病理診斷按照肝炎組織學分級(Grade，G)、NAFLD活動度積分(NAFLD activity score，NAS)來評估。匯管區及周圍、小葉內無炎癥為0級(G0)；匯管區及周圍炎癥，小葉內變性及少數點狀壞死為1級(G1)；匯管區及周圍輕度碎屑壞死，小葉內變性，點、灶狀壞死或嗜酸小體為2級(G2)；匯管區及周圍中度碎屑壞死，小葉內融合壞死或見橋接壞死為3級(G3)；匯管區及周圍重度碎屑壞死，小葉內橋接壞死廣泛，累及多個小葉(多小葉壞死)為4級(G4)。NAS積分(0～8分)：(1)肝細胞脂肪變：0分(<5%)；1分(5%～33%)；2分(34%～66%)；3分(>66%)。(2)小葉內炎癥(20倍鏡計數壞死灶)：0分(無)；1分(<2個)；2分(2～4個)；3分(>4個)。(3)肝細胞氣球樣變：0分，無；1分，少見；2分，多見。NAS<3分可排除NASH，NAS>4分則可診斷NASH，介于兩者之間為NASH可能。規定不伴有小葉內炎癥、氣球樣變和纖維化但肝脂肪變>33%者為非酒精性脂肪性肝，脂肪變達不到此程度者僅稱為肝細胞脂肪變。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況觀察 造模階段：造模組大鼠逐漸出現皮毛光澤度變差，活動量減少，食欲降低，大便質軟、稀，飲水增多，而空白組大鼠普遍毛發光整，活動力強，進食飲水量無異常，大便性狀正常。干預階段：經灌胃干預后，易善復組、威靈仙多糖組大鼠食欲欠佳，活動力、皮毛不光整情況較模型組有所改善；但各組大鼠體質量增加都相對緩慢；對照組大鼠進食飲水量無異常、活動力正常、毛發較為光整。模型組、易善復組、威靈仙多糖組大便性狀仍舊軟、稀，飲水仍較多，三組間無明顯差異,且與造模期間比較無明顯差異；對照組大便性狀正常。

2.2 各組大鼠胰島素抵抗情況 造模階段：隨著造模時間延長，造模組HOMA-IR逐漸升高，空白組HOMA-IR未見明顯升高，兩組間差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。干預階段：采用ELISA法檢測，實際測出血液樣品：對照組5份、模型組8份、威靈仙多糖組10份、易善復組9份。對照組HOMA-IR與模型組HOMA-IR間的差異有顯著性統計學意義(P<0.01)；威靈仙多糖組與模型組間的差異有顯著性統計學意義(P<0.01)；易善復組與模型組間的差異存在顯著性統計學意義(P<0.01)；對照組、威靈仙多糖組和易善復組兩兩比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

表1 造模階段空白組和造模組的HOMA-IR比較Tab 1 Comparison of HOMA-IR between blank group and building model group in modeling stage

表2 干預階段各組的HOMA-IR比較Tab 2 Comparison of HOMA-IR among 4 groups in intervention stage

2.3 各組大鼠血清RBP4的含量 干預結束后，對照組與模型組RBP4差異有顯著統計學意義(P<0.01)；威靈仙多糖組與模型組間的差異存在統計學意義(P<0.01)；易善復組與模型組間差異存在統計學意義(P<0.01)；對照組、威靈仙多糖組和易善復組兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

2.4 光鏡下造模階段肝臟病理學變化 造模組4周末表現為：Ⅱ度肝細胞脂肪變(NAS積分2分)，肝細胞部分氣球樣變(NAS積分1分)，未見炎癥壞死(NAS積分0分)，NAS總積分3分；8周末表現為：Ⅳ度肝細胞脂肪變(NAS積分3分)，肝細胞較多氣球樣變(NAS積分2分)，部分門管區少量炎性細胞浸潤及小葉內多數灶狀壞死(NAS積分3分)，NAS總積分8分；12周末表現為：Ⅳ度肝細胞脂肪變(NAS積分3分)、肝細胞較多氣球樣變(NAS積分2分)，小葉內少數點狀壞死(NAS積分2分)，NAS總積分7分；16周末表現為：Ⅳ度肝細胞脂肪變(NAS積分3分)，肝細胞較多氣球樣變(NAS積分2分)，部分門管區少量炎性細胞浸潤及小葉內多數灶狀壞死(NAS積分3分)，NAS總積分8分(見圖1)?？瞻捉M4個時間點的情況類似，均未見明顯肝細胞脂肪變或氣球樣變或炎癥壞死，NAS總分為0(見圖2)。

表3 各組大鼠血清RBP4含量(ng/ml)Tab 3 Levels of RBP4 in each group (ng/ml)

2.5 大鼠血清RBP4與HOMA-IR的相關性 HOMA-IR與RBP4的相關性采用Pearson相關性分析，r=0.541(P=0.001)，二者呈正相關關系(見圖3)。

圖1 造模組肝臟病理學變化(200×) A:4周末; B:8周末; C:12周末; D:16周末Fig 1 Pathological changes of liver in building model group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks；D： 16 weeks

圖2 空白組肝臟病理學變化(200×) A:4周末; B:8周末; C:12周末; D:16周末Fig 2 Pathological changes of liver in the blank group (200×) A: 4 weeks; B: 8 weeks; C: 12 weeks；D： 16 weeks

圖3 RBP4與HOMA-IR的相關性分析Fig 3 Correlation analysis of RBP4 and HOMA-IR

3 討論

NAFLD的發病機制至今仍不明確，二次打擊學說是被廣泛接受的一種學說，其中首次打擊就是以胰島素抵抗為關鍵環節所致的肝臟脂肪變性和脂質沉積[5]。由于發病機制尚不明確，因此缺乏明確有效的長期治療藥物。威靈仙是一種常用的中藥，含有皂甙類、黃酮類、生物堿類化合物、糖類等多種成分[6]。研究[7]發現，植物多糖有抗炎、抗衰老等多樣的生物學功能，并參與了生物體免疫功能的調節。還有研究[8]發現，蟲草多糖對免疫性肝損傷及化學性肝損傷有保護作用，黨參多糖能有效降低糖尿病小鼠升高的血糖、TC、TG水平，并抑制小鼠的糖異生，調節糖脂代謝，有效改善胰島素抵抗[9]。

RBP4是近年發現的一種新的脂肪因子，大部分RBP4是在肝臟中合成，其次為脂肪組織(占肝臟的20%～40%)，它廣泛分布在人的血液、腦脊液、尿液等體液中，但血液中含量最高[10]。RBP4能激活脂肪組織中巨噬細胞的JNK信號通路，誘導巨噬細胞產生IL-6、TNF-α等促炎因子，激活脂肪組織中的炎性信號通路，阻礙正常的酪氨酸磷酸化，導致胰島素抵抗[11]。血清中高水平RBP4可通過Toll樣受體4激活巨噬細胞，產生一系列的炎癥、免疫反應，激活IκB激酶(IκB kinase，IKK)，激活的IKK一方面抑制胰島素信號轉導，另一方面上調炎性因子水平，進一步通過JNK、IKK、細胞因子信號轉導抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS-3)形成一種低度的炎性信號環境，加速胰島素抵抗的發展[12]。在本研究中，大鼠HOMA-IR在模型組與空白組存在差異，大鼠血清RBP4水平在模型組與空白組存在差異，HOMA-IR與RBP4呈正相關關系。說明RBP4參與了NASH的發生發展，機制可能是通過激活不同的因子、酶及相關炎癥通路等，影響胰島素對物質的代謝調節作用和胰島素正常的信號轉導，最終出現胰島素抵抗，并導致NASH的產生。

植物多糖具有降血糖、調節血脂、免疫調節、抗炎、抗腫瘤等多種多樣的藥理作用[13]。本實驗經過藥物干預后表明：威靈仙多糖組HOMA-IR較模型組有所下降，威靈仙多糖組血清RBP4較模型組有所下降，說明威靈仙多糖可有效降低NASH大鼠的血清RBP4水平，進而改善胰島素抵抗。本研究肯定了威靈仙多糖對NASH大鼠胰島素抵抗的改善作用。

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(責任編輯：王全楚)

Intervention effect of polysaccharide of radix clematidis in RBP4 level and HOMA-IR of rats with non-alcoholic steatohepatitis

HU Minmin,WANG Wei,BI Hongzhong,PAN Jin,JU Jian

Department of Special Wards Branch,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650101,China

Objective To study the intervention effect of polysaccharide of radix clematidis (PRC) in insulin resistance of rats with non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and the correlation between homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) and serum retinol binding protein 4 (RBP4) of rats with NASH. Methods Modeling stage: 14 rats were selected randomly from 50 clean healthy male SD rats and assigned to the blank group,then the remaining 36 rats were used as building model group. Blank group was reared with normal diet. Building model group was reared with high fat diet to establish the rat model of NASH. Intervention stage: after the experimental rat model of NASH establishing successfully,the remaining 30 rats of building model group were divided into model group,the polyene phosphatidyl choline (PPC) group,PRC group,randomly,each group contained 10 rats. The remaining 8 rats of blank group were used as the control group. Four groups were respectively intervened with 0.9% NS,PPC,PRC,and 0.9% NS by gavage. After 8 weeks,the fasting glucose,fasting insulin and serum RBP4 in each group were detected and the correlation of HOMA-IR and serum RBP4 was analyzed by statistical methods. Results HOMA-IR and the level of serum RBP4 in PRC group were lower than those in the model group (P<0.05). The HOMA-IR was positively related with serum RBP4 in NASH rats (r=0.541,P=0.001). Conclusion PRC is effective in treating NASH rats. The main mechanism may be improved insulin resistance of rats with NASH by reducing serum RBP4 levels.

Non-alcoholic steatohepatitis; Retinol binding protein 4; Polysaccharide of radix clematidis

云南省衛生科技廳計劃項目(內設機構)(2012ws 0091)

胡敏敏，碩士，研究方向：消化系統疾病。E-mail: angiemin@sina.com

琚堅，教授，主任醫師，研究方向：中西醫結合方法治療消化系統疾病。E-mail:jujianyn@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.007

R575.5

A

1006-5709(2016)04-0386-05

2015-09-15