恩替卡韋和干擾素序貫作用對HepG2.2.15細胞HBVDNA復制的影響

楊 偉，趙 超，李 婧，丁 揚，王 雪

解放軍第89醫(yī)院傳染科，山東 濰坊 261021

論著·肝相關疾病

恩替卡韋和干擾素序貫作用對HepG2.2.15細胞HBVDNA復制的影響

楊 偉，趙 超，李 婧，丁 揚，王 雪

解放軍第89醫(yī)院傳染科，山東 濰坊 261021

目的 探討恩替卡韋(Entecavir，ETV)與干擾素(IFNα-2b)序貫作用對HepG2.2.15細胞HBV DNA復制的影響。方法 將培養(yǎng)HepG2.2.15細胞分組，單獨組中分別加入不同濃度ETV的配制液(1.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml)或IFNα-2b配制液(5 000 IU/ml、10 000 IU/ml、15 000 IU/ml)；聯(lián)合組中聯(lián)合加入ETV和IFNα-2b配制液；序貫組中先后加入ETV和IFNα-2b序貫配制液。在不同時點，采用MTT法檢測HepG2.2.15細胞增殖情況，采用實時熒光定量法檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA水平，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測上清液中HBsAg與HBeAg水平。結果 隨著時間延長，序貫組對HepG2.2.15的HBV DNA復制抑制作用明顯大于其他兩組(P<0.05)；對HBsAg與HBeAg的抑制作用隨時間的延長而加強(P<0.05)。結論 ETV與IFNα-2b序貫作用于HepG2.2.15細胞，對HepG2.2.15細胞HBV DNA復制有明顯的抑制作用，且作用強于單獨或聯(lián)合使用。

恩替卡韋；干擾素α-2b；HepG2.2.15細胞；HBV DNA；序貫作用

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是我國引起肝硬化、肝功能衰竭及肝細胞癌的主要原因[1]。恩替卡韋(Entecavir，ETV)是目前臨床常用的核苷酸類似物藥物，它能阻止病毒DNA鏈的延伸，使病毒停止擴增，但需長期用藥，且遠期療效有待觀察。干擾素α-2b(interferon α-2b，IFNα-2b)是一種多功能免疫調節(jié)因子，其抗HBV機制可能涉及多方面[2]。雖然上述兩種藥物的抗病毒效果已取得共識，但在采用單獨、聯(lián)合或序貫使用藥物抗病毒治療等方式上仍存在較大爭議，一方面認為序貫抗病毒治療可以引起病毒的耐藥性，導致后序治療更加困難[3]，而另一方面認為序貫抗病毒治療可以很好的控制乙肝患者體內的病毒數(shù)量，改善患者的生活質量[4]。本實驗以體外的HepG2.2.15細胞建立HBV DNA復制模型，從體外實驗角度探討上述各種治療方法的優(yōu)缺點，為HBV臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 HepG2.2.15細胞株購自上海瑞鹿生物科技有限公司。精制小牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司。ETV由福建廣生堂股份有限公司生產，ETV液制備：ETV 2片(0.5 mg/片)，研磨成粉，加入20 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液，室溫攪拌2 h，過濾除菌，調整為1.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ亟M人IFNα-2b注射液(安福隆)3 000 000 U、由天津華利達生物有限公司生產，干擾素液制備：取母液30 ml，加入2 970 μl完全培養(yǎng)基，混勻，調整為5 000 IU/ml、10 000 IU/ml、15 000 IU/ml，-20 ℃保存?zhèn)溆谩ｊ幮詫φ找海喝?%二甲亞砜(DMSO) 30 μl母液加入2 970 μl完全培養(yǎng)基，混勻。

1.2 分組及藥物處理方法 從液氮罐中取出HepG2.2.15細胞，迅速水浴后，將其加入含有細胞培養(yǎng)液的離心管中，混勻離心棄去上清后漿細胞懸液置于含有5 ml的細胞培養(yǎng)基中，放入細胞培養(yǎng)箱。待細胞長成單層后，用0.25%的胰酶消化，每周傳代一次，將HepG2.2.15細胞分為：(1)單獨ETV組：96孔板，10 000細胞/孔，培養(yǎng)24 h后分別加入3種濃度ETV液200 μl，在2、4、6 d收集培養(yǎng)上清液用于檢測;(2)單獨IFNα-2b組：96孔板，10 000細胞/孔，培養(yǎng)24 h后分別加入上述3種不同濃度IFNα-2b 200 μl，同上收集上清液;(3) 聯(lián)合作用組：96孔板，10 000細胞/孔，培養(yǎng)24 h后加入ECT與IFNα-2b混合藥液，同上收集上清液;(4) 序貫作用組：取中等濃度(5 μg/ml)ETV溶液加入培養(yǎng)基中處理3 d，補加中等濃度(10 000 IU/ml)500 μl的IFNα-2b處理1 d，取上清液0.5 ml，再加IFNα-2b(10 000 IU/ml)500 μl，2 d后留取上清0.5 ml，-70 ℃凍存。上述各組每孔復設4個復孔;(5) 陰性對照組：取母液30 μl，加入2 970 μl完全培養(yǎng)基混勻，在相應時點取標本進行各項指標檢測。

1.3 ETV與IFNα-2b對HepG2.2.15細胞增殖影響的檢測 MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自北京Solarbio科學技術有限公司。將各組的細胞板吸取孔內液體留存后，每孔加入90 μl新鮮培養(yǎng)液，再加入110 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸取上清，每孔加入110 μl Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)490 nm處各孔的吸光值。陽性對照為1%的DMSO溶液，陰性對照為未加入藥液的培養(yǎng)基留置最后一孔作為空白孔。

1.4 HBV DNA的檢測 取上述細胞培養(yǎng)上清液3 μl進行HBV DNA定量測定，采用PCR-熒光探針“一管法”，BioRadcfx96型全自動熒光擴增儀購自美國BioRad公司，試劑盒購自北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司，產品標準編號為YZB/國0443-2013，操作按說明書進行。1.5 HBsAg與HBeAg水平的檢測 取上述細胞培養(yǎng)上清液50 μl用于HBsAg與HBeAg檢測，采用 ELISA，試劑盒購自北京生物技術研究所，操作按說明書進行。

2 結果

2.1 ETV、IFNα-2b對HepG2.2.15細胞增殖的影響單獨作用時，不同濃度ETV對HepG2.2.15細胞的增殖無明顯抑制作用，而不同濃度的IFNα-2b對HepG2.2.15細胞有一定抑制率，與ETV組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 ETV、IFNα-2b單獨作用對HepG2.2.15細胞生長的抑制作用Tab 1 The inhibition effect of HepG2.2.15 cells replication by individual treatment with ETV and IFNα-2b

2.2 各組對HepG2.2.15細胞HBsAg與HBeAg表達的影響 隨著時間的延長，IFNα-2b組、聯(lián)合作用組、序貫作用組對HBsAg分泌抑制作用明顯增強(P<0.05)；單用IFNα-2b組與聯(lián)合作用組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；序貫組抑制率明顯強于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。另IFNα-2b組、聯(lián)合作用組、序貫作用組對HBeAg抑制作用明顯強于ETV組(P<0.05)；單用IFNα-2b組與聯(lián)合作用組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；序貫組對HBeAg抑制作用強于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

表2 ELISA法檢測HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清HBsAg的抑制率(%)Tab 2 The HBsAg inhibition ratio of the supermatant HepG2.2.15 cells by ELISA (%)

表3 ELISA法檢測HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清HBeAg的抑制率(%)Tab 3 The HBeAg inhibition ratio of the supermatant HepG2.2.15 cells by ELISA (%)

2.3 各組對HBV DNA復制的抑制作用 各實驗組對HBV DNA有明顯的抑制作用，且隨著時間的延長，抑制作用增強；但各實驗組之間抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表4)。

表4 各組HBV DNA定量檢測情況(copies/ml)Tab 4 The quantitative detection results of HBV DNA in each group (copies/ml)

3 討論

ETV是核苷酸類似物的代表性藥物，它能阻止病毒在肝細胞內逆轉錄過程中DNA鏈的延伸，使病毒停止擴增。然而只有長期用藥才能最大限度的維持病毒的低水平，大量臨床資料證明核苷酸類似物對于HBV ccDNA無直接清除作用[5]，且容易誘導病毒產生耐藥的變異，導致用藥期間病毒的反跳。IFNα-2b是一種多功能免疫調節(jié)因子，可誘導細胞產生抗病毒蛋白，具有特殊的抗病毒作用[6]。HepG2.2.15細胞株是由2個頭尾相連的HBV DNA全基因重組質粒沾染受體細胞HepG2而獲得的，可在體外增殖，在細胞培養(yǎng)上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的DANE顆粒，同時還能產生大量的復制中間體，是目前各實驗室廣泛用于篩選和評價體外抗HBV藥物良好的實驗模型[2]。

本實驗采用HepG2.2.15細胞株為模型，觀察上述不同用藥方法時，各項指標被藥物抑制的動力學效果。實驗結果表明，ETV對HepG2.2.15細胞的自身增殖無明顯抑制作用，而IFNα-2b對HepG2.2.15細胞自身增殖有明顯抑制作用，與臨床上觀察到單用干擾素抗病毒治療時，其療效和毒副作用均大于核苷酸類藥物的現(xiàn)象一致。雖然各實驗組對HBV DNA都有較高的抑制率，但隨著時間的延長，聯(lián)合組和序貫組對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg有明顯抑制作用，以序貫組作用最強，差異有統(tǒng)計學意義，提示序貫療法可能成為一種治療乙肝的有效方式。可是由于實驗時間過短，藥物能否導致病毒變異這一情況未能在本實驗中體現(xiàn)，因此序貫療法能否長時間在人體內有這種實驗學現(xiàn)象仍需進一步探索和驗證。本實驗結果部分支持了基于“路線圖”聯(lián)合治療，及序貫治療的有效性和可行性。但在臨床治療應用時，患者體質狀況、病毒的變異程度、治療費用對患者依從性的影響及社會的費用效益比等，都影響治療方案的選擇，所以在臨床治療時，我們應綜合各種因素判斷，慎重選擇適當?shù)闹委煼椒ā?/p>

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[3]Janssen HL,van Zonneveld M,Senturk H,et al. Pegylated interferon alfa-2b alone or in combination with lamivudine for HbeAg-positive chronic hepatitis B: a randomised trial [J]. Lancet,2005,365(9454): 123-129.

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(責任編輯：王全楚)

The effect on replication of HBV DNA in HepG2.2.15 cells by the sequential treatment with Entecavir following interferon α-2b

YANG Wei,ZHAO Chao,LI Jing,DING Yang,WANG Xue

Department of Infectious Disease,the 89th Hospital of PLA,Weifang 261021,China

Objective To investigate the effect on replication of HBV DAN in HepG2.2.15 cells by the sequential treatment with Entecavir (ETV) following interferon α-2b (IFNα-2b). Methods In individual groups,HepG2.2.15 cells were treated with various concentrations of ETV (1.5 μg/ml,5 μg/ml,10 μg/ml) and IFNα-2b (5 000 IU/ml,10 000 IU/ml,15 000 IU/ml) individually; in combination group,HepG2.2.15 cells were treated with ETV and IFNα-2b combination; in sequential groups,HepG 2.2.15 cells were treated with ETV following IFNα-2b. The method of determined proliferation was MTT; HBV DNA copies were detected by Real time PCR-fluorescence probing in one-tube method from the supermatant of HepG 2.2.15 cells; HBsAg and HBeAg expressions from the supermatant were measured by ELISA at different time points. Results Compared with the individual groups or the combination group,sequential group had more powerful inhibition effects on HBV DNA replication,the more powerful inhibition expressions of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells. Conclusion The sequential treatment with ETV following IFNα-2b has more powerful effect on replication of HBV DNA than the individual treatment or combination treatment.

Entecavir; Interferon α-2b; HepG2.2.15 cells; HBV DNA; Sequential treatment

楊偉，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：肝病。E-mail：ywcyw723@sina.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.04.012

R512.6+2

A

1006-5709(2016)04-0408-03

2015-09-20