熊果酸通過下調COX-2表達降低人胃癌HGC-27細胞侵襲能力研究

豐 安，周青山

武漢大學人民醫院重癥醫學科，湖北 武漢 430060

其他論著

熊果酸通過下調COX-2表達降低人胃癌HGC-27細胞侵襲能力研究

豐 安，周青山

武漢大學人民醫院重癥醫學科，湖北 武漢 430060

目的 觀察熊果酸對人胃癌HGC-27細胞侵襲能力的影響，并探討可能的作用機制。方法 體外培養HGC-27細胞，分為對照組和實驗組，實驗組用不同濃度(15、30、60 μmol/L)熊果酸處理HGC-27細胞24 h，對照組加入等體積的培養基，Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力；Western blotting 檢測基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、環氧化酶-2(COX-2)及 p-NF-κB的表達。結果 與對照組比較，熊果酸可顯著降低HGC-27細胞侵襲能力；經熊果酸處理后，MMP-9表達下調；熊果酸可抑制COX-2及其上游調控基因p-NF-κB的表達。結論 熊果酸可降低人胃癌HGC-27細胞侵襲能力，其機制可能與抑制p-NF-κB、下調COX-2表達、降低MMP-9表達有關。

熊果酸；HGC-27細胞；侵襲；環氧化酶-2；NF-κB

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，且起病隱匿、發展迅速，死亡率居腫瘤相關死亡率前列[1]。我國胃癌的發病率和死亡率居各種惡性腫瘤的首位，嚴重威脅著我國人民群眾的生命健康。侵襲和轉移是導致胃癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因。盡管腫瘤治療方法不斷發展與更新，新的抗腫瘤藥物層出不窮，但胃癌患者長期生存率并沒有明顯提高。因此，迫切需要找到抑制腫瘤侵襲和轉移的新方法和策略。

熊果酸(Ursolic acid)，又稱烏索酸，廣泛存在于包括白花蛇舌草、女貞子、烏梅、夏枯草等在內的天然植物中，藥理學研究證實，熊果酸具有抗炎、抗病毒、免疫調節、鎮靜、護肝等多種藥理學作用[2]。此外，熊果酸還具有抗腫瘤作用。研究[3-6]已經證實，熊果酸可抵抗包括苯并芘、黃曲霉素在內的多種致癌物質的致癌效應，且在體內外對多種腫瘤細胞均有抑制作用。然而，熊果酸抗腫瘤的具體機制仍不清楚，需要進一步探討。本研究以胃癌HGC-27為研究對象，觀察熊果酸對胃癌HGC-27細胞侵襲能力的影響，并探討分析熊果酸可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 細胞株：胃癌HGC-27細胞，購自中國科學院上海細胞庫，由武漢大學人民醫院中心實驗室凍存；主要試劑：熊果酸購自Sigma公司；胎牛血清購自GIBCO公司，RPMI1640培養液、蛋白提取試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司；Transwell小室購自Corning公司；Matrigel膠購自BD公司；COX-2、MMP-9、p-NF-κB(p65)及β-actin抗體購自Cell Signaling Technology公司。辣根酶標記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組：細胞接種到培養瓶中后置于37 ℃ 5% CO2的細胞培養箱中，培養2～3 d后觀察培養基顏色及培養瓶內細胞長勢，若培養基顏色變淡而細胞未長滿則將培養瓶從培養箱中取出，在無菌操作臺上操作，棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2～3遍，加入適量新培養基，繼續放入培養箱中培養。該實驗分為4組：對照組、15 μmol/L熊果酸組、30 μmol/L熊果酸組和60 μmol/L熊果酸組，作用時間均為24 h。

1.2.2 Transwell法檢測細胞侵襲能力：將Matrigel膠放置于4 ℃冰箱中過夜，用4 ℃預冷的無血清培養基稀釋融化后的Matrigel膠至終濃度為1 mg/ml；將100 μl稀釋后的Matrigel膠加入Transwell小室底部中間區域，讓膠體自由向四周擴散，使其均勻地鋪在小室底部，37 ℃培育5 h使其干成膠狀；實驗前將細胞培養試劑和Transwell小室放在37 ℃條件下預熱；將生長期的各組血清細胞饑餓12 h，收集細胞，用PBS和無血清培養基先后各洗滌1次，1 500 r/min離心5 min后，用無血清培養基重懸計數，調整細胞密度約2×105/ml；將600 μl 含10%血清培養基加入24孔板底部，150 μl細胞懸液加入Transwell小室內，用鑷子將小室轉移至含10%血清培養基的24孔板中，繼續在細胞培養箱中培養24 h；24 h后，用鑷子小心取出小室，吸干小室內培養基，用經PBS濕潤的棉簽輕拭小室內的細胞后將小室移到含800 μl甲醇的孔中，室溫下放置固定30 min；30 min后取出小室并吸干室內固定液，移到含結晶紫染液的孔中，室溫下放置染色15 min；15 min后用清水浸泡并輕輕沖洗數次，然后取出小室，吸去上室液體，用鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干；顯微鏡下取5個隨機視野計數，統計結果。

1.2.3 Western blotting檢測COX-2、MMP-9、p-NF-κB蛋白表達：細胞接種及分組同上，收集細胞，用冷的PBS洗滌3遍，棄去PBS，加入三去污蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，用雙蒸水泡過的細胞刮收集瓶中液體于EP管中，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，吸取上清，置于-80 ℃冰箱中儲存。聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白質濃度，加入5×上樣緩沖液至提取的細胞蛋白樣品中，沸水煮沸5 min使蛋白變性。將膠板固定在電泳架上，加入電泳緩沖液，每孔加入40 μg蛋白樣品，同時在兩側的上樣孔中加入5 μl蛋白Marker作為分子量參照。電泳結束后轉膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂奶粉封閉1 h，根據條帶蛋白分布不同加入1∶1 000稀釋的兔抗人COX-2、MMP-9、p-NF-κB(p65)抗體，放入4 ℃冰箱內搖床上孵育過夜，其中β-actin為內參，次日洗滌緩沖液(TBST)洗膜后，根據一抗來源不同分別加入1∶1 000稀釋的辣根酶標記的山羊抗兔二抗，室溫放置2 h，再次TBST洗膜，使用ECL化學發光試劑，在室溫下孵育PVDF膜后放入暗盒中，暗室紅燈下曝光1 min，然后顯影，定影，對膠片進行拍照分析。

2 結果

2.1 熊果酸對胃癌HGC-27細胞侵襲能力的影響 如圖1所示，15、30、60 μmol/L熊果酸處理HGC-27細胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，穿過Trasnwell小室基底膜的細胞數逐漸減少，與對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。

注：與對照組相比，*P<0.05。

圖1 熊果酸對胃癌HGC-27細胞侵襲能力的影響(100×) A：對照組；B：15 μmol/L熊果酸組；C：30 μmol/L熊果酸組；D：60 μmol/L熊果酸組；E：各組細胞數比較
Fig 1 Effect of Ursolic acid on the invasive ability in HGC-27 cells (100×) A：control group；B：Ursolic acid 15 μmol/L group；C：Ursolic acid 30 μmol/L group；D：Ursolic acid 60 μmol/L group；E：comparison of HGC-27 cells among each group

2.2 熊果酸對胃癌HGC-27細胞MMP-9表達的影響 0、15、30、60 μmol/L熊果酸處理HGC-27細胞24 h后，Western blotting檢測結果顯示,隨著藥物濃度的升高,MMP-9表達逐漸降低(見圖2)。

圖2 熊果酸對胃癌HGC-27細胞MMP-9表達的影響
Fig 2 Effect of Ursolic acid on the expression of MMP-9 in HGC-27 cells

2.3 熊果酸對胃癌HGC-27細胞COX-2表達的影響 不同濃度熊果酸(0、15、30、60 μmol/L)處理HGC-27細胞24 h后，隨著藥物濃度的升高，COX-2表達逐漸降低(見圖3)。

圖3 熊果酸對胃癌HGC-27細胞COX-2表達的影響
Fig 3 Effect of Ursolic acid on the expression of COX-2 in HGC-27 cells

2.4 熊果酸對胃癌HGC-27細胞NF-κB表達的影響 HGC-27細胞經不同濃度熊果酸(0、15、30、60 μmol/L)處理24 h后，隨著藥物濃度的升高，細胞核內p-NF-κB(p65)表達量減少，呈濃度依賴性(見圖4)。

圖4 熊果酸對胃癌HGC-27細胞核內p-NF-κB表達的影響
Fig 4 Effect of Ursolic acid on the expression of NF-κB in HGC-27 cells

3 討論

侵襲和轉移是導致胃癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因。胃癌早期無特異性表現，盡管胃鏡檢查能發現早期胃癌，但因其是一項侵入性檢查，多數患者不能接受，導致就診時已是中晚期。因此，長期以來，人們一直在尋找抑制腫瘤侵襲和轉移的新方法和策略。

細胞外基質及基底膜的降解破壞在腫瘤細胞從原發灶脫離穿過組織屏障、導致細胞侵襲轉移過程中起關鍵作用。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPS)是一類鋅離子依賴的細胞外蛋白水解酶，可降解細胞外基質、破壞基底膜，促進腫瘤的侵襲、轉移。MMP-9是MMPs中明膠酶的一種，在多種腫瘤中表達上調，可降解細胞外基質中的Ⅳ型膠原，參與腫瘤的侵襲、轉移[7-8]。本實驗采用Tanswell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力，其原理是將Matrigel膠鋪在人工膜表面，模擬體內的細胞外基質，腫瘤細胞必須借助自身分泌的一些蛋白酶破壞細胞外基質后才可通過人工膜，繼而反映腫瘤細胞侵襲力的強弱。結果提示，熊果酸可通過下調MMP-9表達降低HGC-27細胞侵襲能力。

研究[9]證實，COX-2在許多上皮性質腫瘤包括結直腸癌、非小細胞肺癌、胰腺癌及頭頸部腫瘤中過表達，且與不良預后密切相關[10-11]。過表達的COX-2又可產生大量的PGE2，共同參與細胞惡性轉化、抑制細胞凋亡、促進腫瘤血管新生、抑制抗腫瘤免疫等機制調控多種腫瘤發生、血管生成、侵襲、轉移等[12]。因此，COX-2可能是抗腫瘤作用的靶點。本實驗發現，熊果酸處理后細胞COX-2表達顯著降低。

NF-κB作為炎癥反應的調控基因，參與了COX-2的催化反應，因此本實驗進一步檢測熊果酸對NF-κB/p65表達的影響，結果顯示，熊果酸處理后，細胞核內p-NF-κB(p65)表達量減少，呈濃度依賴性。提示熊果酸能抑制HGC-27細胞NF-κB由胞漿向核內移位。

綜上所述，本研究結果提示熊果酸在體外可抑制胃癌HGC-27細胞侵襲能力，其作用機制可能是通過抑制p-NF-κB(p65)表達進而下調COX-2表達，降低MMP-9水平。其對其他腫瘤細胞作用及其抗腫瘤機制尚需進一步探索和研究。

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(責任編輯：李 健)

Research of Ursolic acid inhibits cell invasiveness by suppressing the COX-2 expression in HGC-27 gastric cancer cells

FENG An,ZHOU Qingshan

Department of Intensive Care Unit,People’s Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective To investigate the effect of Ursolic acid on the cell invasiveness in HGC-27 gastric cancer cells and explore the possible mechanisms. Methods HGC-27 cells were cultured in vitro. The experiments were divided into two groups,including control group and experiment group. The control group received only the culture medium. After treatment by Ursolic acid in different concentrations (15 μmol/L,30 μmol/L and 60 μmol/L) respectively for 24 hours,the invasion of HGC-27 cells were tested by Transwell assay. Western blotting was used for MMP-9,COX-2 and p-NF-κB protein analysis. Results Compared with control group,the invasion of HGC-27 cells was significantly decreased in experiment group. The data of Western blotting showed that Ursolic acid decreased the expression of MMP-9,COX-2 and upstream effector of p-NF-κB in a dose-dependent manner. Conclusion Ursolic acid inhibits the cell invasion in HGC-27 cells,and the effects of antitumor may be associated with inhibition of the expression of p-NF-κB,down-regulating the expression of COX-2 and MMP-9.

Ursolic acid; HGC-27 cells; Invasiveness; Cyclouxygenase-2; NF-κB

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.02.019

豐安，碩士，研究方向：重癥監護及治療。E-mail: fenganjzk@163.com

周青山，博士，主任醫師，教授，研究方向：重癥監護及治療。E-mail: zhougingshanzz@126.com

R735.2

A

1006-5709(2016)02-0184-04

2015-07-20