93例B細胞非霍奇金淋巴瘤患者骨髓受累的診斷分析*

喬文斌，冶　薇，黃艷春

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，新疆烏魯木齊 830011)

?

·論著·

93例B細胞非霍奇金淋巴瘤患者骨髓受累的診斷分析*

喬文斌，冶薇，黃艷春△

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，新疆烏魯木齊 830011)

摘要:目的探討骨髓細胞形態學與流式細胞在檢測B細胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)骨髓受累中的價值。方法B-NHL患者同時做骨髓涂片和流式細胞檢測。骨髓涂片經瑞士吉姆薩染色，分類計數骨髓細胞；流式細胞檢測先處理樣本后加熒光染色，上機處理。結果93例B-NHL患者經骨髓涂片檢測陽性者為11例，陽性率為11.8%；經流式細胞檢測陽性者為27例，陽性率為29.0%，兩種方法比較差異有統計學意義(P<0.05)。在11例骨髓涂片陽性的樣本中，有1例經流式細胞檢測為陰性。結論骨髓涂片和流式細胞檢測都是診斷B-NHL骨髓受累的重要方法，兩者各有優勢，聯合運用兩種方法可為診斷B-NHL骨髓受累提供更準確的依據。

關鍵詞:非霍奇金淋巴瘤;流式細胞檢測;骨髓受累

惡性淋巴瘤是一組起源于淋巴結和(或)結外部位淋巴組織的惡性腫瘤，分為霍奇金淋巴瘤(HL) 及非霍奇金淋巴瘤(NHL)。B細胞NHL(B-NHL)是NHL常見的一種類型[1]。淋巴結與淋巴組織遍布全身，淋巴液和血液在全身循環，故淋巴瘤可發生和侵犯身體的任何部位，其中骨髓是淋巴瘤常見累及部位，尤其是NHL骨髓侵犯較常見。目前，骨髓涂片形態學檢查是診斷淋巴瘤患者骨髓受累的重要手段，但敏感度低且受很多因素影響易漏檢。由于淋巴瘤細胞單克隆性的特點[2]，用流式細胞儀對其輕鏈進行分析從而得出骨髓中是否存在淋巴瘤細胞，進而可判斷骨髓是否受累。本研究通過分析比較兩種方法在診斷B-NHL患者骨髓受累情況，從而為淋巴瘤患者骨髓受累的診斷提供依據。

1資料與方法

1.1一般資料選取2014年1月至2015年6月本院血液內科經活檢病理組織學診斷初治為B-NHL 患者93例。其中男性51例，女性42例，年齡14～78歲，中位年齡57歲，其中維吾爾族9例、漢族67例、回族10例、哈薩克族7例；按世界衛生組織(WHO)的臨床分期標準，Ⅰ期14例，Ⅱ期23例，Ⅲ期19例，Ⅳ期37例。

1.2儀器與試劑CD19-PECY5/Kappa-FITC/Lambda-PE、溶血素及PBS液均來自美國BECKMAN COULTER公司。檢測使用美國BECKMAN COULTER公司的CYTomios FC500流式細胞儀。瑞氏吉姆薩染液及過氧化物酶(POX)組織化學染液均來自BASO公司。

1.3方法93例B-NHL患者的骨髓標本需由經驗較為豐富的臨床醫師進行采集，抽取骨髓液0.2～0.3 mL置于載玻片上，快速涂片8張，送細胞形態學檢查；更換10 mL無菌注射器，抽取骨髓液1 mL，將抽取的骨髓標本逐滴加入肝素抗凝管中混勻，送流式細胞實驗室檢查。骨髓細胞形態學樣本需當日及時染色處理，流式細胞檢測標本于4 h處理完畢。骨髓細胞學檢測樣本做瑞士吉姆薩染色，并同時作POX組織化學染色，然后對樣本進行分類計數。所有需流式細胞檢測的抗凝骨髓標本按如下方式處理：(1)將骨髓標本用300目分子篩過濾。(2)用5 mL PBS液將骨髓標本洗滌2遍。(3)取1支流式管，加入10 μL熒光標記的單克隆抗體CD19、Kappa、Lambda。(4)在上述試管中加入100 μL洗滌好的骨髓液，微型振蕩器混勻，避光室溫放置20 min。(5)加入溶血素500 μL，微型振蕩器混勻，避光室溫放置20 min。(6)加入500 μL PBS液，避光室溫放置10 min。(7)對流式細胞儀進行常規質量控制。(8)使用Beckman流式細胞儀進行分析，實驗結果從流式細胞儀獲得并用流式細胞相關軟件進行數據處理分析。

1.4質量控制為了保證實驗數據的可靠嚴謹及結果的可信性，減少實驗誤差，在本實驗過程中，骨髓形態學樣本由兩名經驗豐富的形態學工作者檢驗，每個樣本的骨髓片分類計數200個細胞；流式細胞檢測嚴格遵循質量控制原則：分析樣本前，對樣本及時正確處理，正確校準和標準化實驗儀器。確保流式細胞儀激光光路與樣品流處于正交狀態，減少變異，保證樣品檢測時儀器處于最佳工作狀態。免疫熒光染色保證在室溫下進行。操作過程中嚴格遵循試劑盒說明及操作流程。流式細胞儀的檢測由檢驗中心的專人負責，檢測過程完全在質量控制的條件下完成。

1.5判斷標準骨髓涂片的細胞形態學分析，按照盧興國[3]骨髓涂片細胞分類中淋巴瘤細胞大于5%且小于或等于20%者診斷為NHL骨髓侵犯；淋巴瘤細胞大于20%者診斷為NHL合并白血病(淋巴瘤細胞白血病)為標準，判斷骨髓受累情況，診斷時都應做POX組織化學染色。流式細胞檢測用CD19選擇B淋巴細胞，然后分析其輕鏈，選擇B淋巴細胞輕鏈κ/λ>6或小于0.3作為單克隆B淋巴細胞的診斷標準[4]，判斷骨髓受累情況。

1.6統計學處理采用SPSS17.0統計軟件包進行數據處理和統計學分析，率的比較采用χ2檢驗。取檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩種檢測方法陽性情況比較93例B-NHL患者經骨髓涂片陽性者為11例，陽性率為11.8%；經流式細胞檢測陽性者為27例，陽性率為29.0%，兩者比較差異有統計學意義(χ2=8.467，P=0.004)，見表1。在11例骨髓涂片陽性的樣本中，有1例經流式細胞檢測為陰性。

表1　93例B細胞NHL患者兩種檢測方法的比較[n(%)]

*：P<0.05，與流式細胞檢測結果比較。

2.2兩種檢測方法結果判讀情況

2.2.1骨髓形態學檢測93例B-NHL患者在形態學檢測方面，11例陽性的樣本中4例診斷為淋巴瘤細胞白血病，7例診斷為NHL骨髓侵犯。淋巴瘤細胞白血病患者的骨髓象表現為增生極度活躍，淋巴瘤細胞比值高(>20%)，細胞胞體大、核大、核型不規則，核染色質疏松，部分細胞核中可見大小不等的核仁1～2個見圖1(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)；NHL 骨髓侵犯的患者骨髓象表現為增生活躍，淋巴瘤細胞數量較少(5%～20%)，細胞散在分布，形態描述同淋巴瘤細胞白血病患者見圖2(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

2.2.2流式細胞檢測93例B-NHL患者在流式細胞檢測方面，骨髓未受累的患者B細胞的數量較少，Kappa和Lambda的比值范圍為0.3～6,見圖3(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)；骨髓受累的患者B細胞的數量較多，并且Kappa和Lambda相差較大，比值遠小于0.3或遠大于6，見圖4(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。

3討論

NHL是一組來源于淋巴造血系統高度異質性的惡性腫瘤，其發病率比較高，一些地區NHL的發病率可以達到惡性腫瘤發病的前3位。近20年來其發病率和病死率在世界各地均呈現出逐年上升的趨勢[5-6]。B-NHL是NHL常見的一種類型，較易發生骨髓受累，在臨床分期中骨髓是否受累起著關鍵性的作用，一旦骨髓受累，臨床上就將其分到Ⅳ期，因此，骨髓檢查是B-NHL患者診斷和治療過程中必不可少的檢測項目之一。

常用的骨髓檢測方法為骨髓穿刺涂片細胞形態學檢查，本研究的93例B-NHL患者在形態學檢測方面，陽性者為11例，陽性率為11.8%。國內外有報道NHL患者的骨髓侵犯發生率為16%～75%[7-9]，本研究使用骨髓涂片學檢測的結果略偏低。分析原因，與以下幾方面有關：(1)取材部位及涂片的質量。B-NHL患者在做過骨髓穿刺時通常選取的部位為髂后上棘，因該處取材較為安全，成功率高，然而有時部分患者骨髓侵犯的部位未必就在取材的部位；同時涂片的質量也是一個不容忽視的因素，在涂片的操作中，一般找骨髓小粒比較豐富的區域進行，且涂片選取的骨髓量較少，加之分析涂片時也是隨機選取玻片中部及尾部的部分區域進行分類計數，若骨髓侵犯的量較少，容易造成漏診。(2)骨髓瘤細胞的形態特點。B-NHL的病理分型較多，有成熟型的，也有早期未成熟型的，如果患者的病理分型為成熟B淋巴細胞的型別，其骨髓象中淋巴瘤細胞與成熟的淋巴細胞很難辨識區別，如果侵犯的數量也不多，那么在形態學中就極易漏診。本研究方法的11例陽性樣本中4例診斷為淋巴瘤細胞性白血病，7例診斷為NHL 骨髓侵犯。在判斷為陰性的82例樣本中還有10例樣本，其淋巴瘤細胞比例未能達到5%，按照標準未能放入骨髓受累的患者中。

流式細胞技術具有高通量，多參數檢測的優點，近年來越來多的被應用到淋巴瘤的分型及診斷上來。B-NHL是一種單克隆增殖的免疫增殖性疾病，淋巴瘤細胞呈輕鏈限制性，僅表達單一的輕鏈(Kappa輕鏈或者Lamda輕鏈)，而正常B 淋巴細胞呈多克隆表型,既表達Kappa 輕鏈,又表達Lamda輕鏈。本研究利用流式細胞學的優勢以及B-NHL淋巴瘤細胞單克隆性的特點，分析了93例B-NHL患者的骨髓樣本。按照輕鏈κ/λ>6或小于0.3作為單克隆B細胞的診斷標準分析得出陽性者為27例，陽性率為29.0%。在結果中發現，陰性的患者，其B細胞的數量較少，部分患者甚至還未達到1%，故而輕鏈的分析失去了價值。在陽性患者中其B細胞不僅數量多，其輕鏈的表達遠超過判斷標準。

通過比較兩種方法在診斷B-NHL患者骨髓受累的情況，發現流式細胞檢測的陽性率高于骨髓細胞形態學的陽性率。但在具體分析結果時發現，有1例經骨髓細胞學檢測為陽性的患者，在流式細胞檢測中呈陰性，且輕鏈的表達較少，這是否與該患者B細胞表達輕鏈丟失有關，有待進一步研究證實。兩種方法在診斷B-NHL患者骨髓受累時各有其優勢，也有其不足，在具體診斷時應合理選用，如有條件可以同時選用兩種方法。

NHL在臨床上按侵犯范圍分為4期，一旦骨髓受累及即屬于Ⅳ期，預后較差。所以，NHL是否出現骨髓浸潤對分析病情進展、擬訂治療方案、評價預后都具有十分重要的作用。對于分期較晚患者，自體造血干細胞移植是治療B-NHL的重要手段，但若移植前骨髓已受累，并由于移植前治療不充分，移植物中仍有淋巴瘤細胞殘留，則會增加移植后淋巴瘤復發的可能性。因此準確合理診斷B-NHL患者骨髓是否受

累對于正確分期、制定治療方案具有雙重意義。

參考文獻

[1]許文榮，谷俊俠．臨床血液學檢驗[M]．南京：東南大學出版社，2001：256．

[2]王蘭蘭,許化溪.臨床免疫學檢驗[M].北京：人民衛生出版社，2012:298-311.

[3]盧興國．造血和淋巴組織腫瘤現代診斷學[M]．北京：科學出版社，2005：482．

[4]B?ttcher S,Ritgen M,Buske S,et al.Minimal residual disease detection in mantle cell lymphoma:methods and significance of four-color flow cytometry compared to consensus IGH-polymerase chain reaction at initial staging and for follow-up examinations[J].Haematologica,2008,93(4):551-559.

[5]Huh J.Epidemiologic overview of malignant lymphoma[J].Korean J Hematol,2012,47(2):92-104.

[6]袁延楠，楊雷，孫婷婷，等．1998～2010年北京市戶籍居民惡性淋巴瘤發病情況[J]．中華預防醫學雜志，2014，48(8)：669-673．

[7]劉恩彬，陳輝樹，張培紅，等．侵犯骨髓的非霍奇金淋巴瘤41例病理診斷探討[J]．診斷病理學雜志，2011，6(3)：178-181．

[8]萬祥輝，楊細媚，鄒學森．淋巴瘤侵犯骨髓患者初次血常規綜合指標分析[J]．實用檢驗醫師雜志，2013，12(4)：241-242．

[9]宋衛衛，謝彥，鄧麗娟，等．流式細胞技術對非霍奇金淋巴瘤骨髓侵犯的診斷價值[J]．中華醫學雜志，2014，10(94)：2996-3000．

The analyse of examining the bone marrow involvement in ninety-three patients of non-Hodgkin′s lymphoma*

QiaoWenbin,YeWei,HuangYanchun△

(DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi,Xinjiang830011,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the value of combined detection of bone marrow smear(BMS) and flow cytometry(FCM) to examine bone marrow involvement(BMI)of B cell non-Hodgkin′s lymphoma(B-NHL).MethodsPatients with B-NHL were detected by BMS and FCM simultaneously.Smears were stained with Wright-Giemsa′s staining to differentially count neoplastic cells and the processed sample with fluorescent staining for the FCM.Results93 cases of patients with B-NHL were detected.The detection rate of BMS and FCM were 11.8% and 29.0%.There was statistical difference of detection rate between the two method(P<0.05).In 11 cases patients of BMI with the method of BMS,while using the method of FCM 10 cases were positive.ConclusionBoth BMS and FCM are useful to diagnose BMI of B-NHL,each of them has individual characteristics.Combined detection of these two methods can increase the diagnostic of BMI.

Key words:non-Hodgkin′s lymphoma；flow cytometry；bone marrow involvement

(收稿日期：2016-01-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.007

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1175-03

*基金項目：新疆醫科大學科研創新基金資助項目(XJC201390)。

作者簡介：喬文斌，男，主管檢驗師，主要從事臨床血液學檢驗研究。△通訊作者，E-mail：huangyanchun0619@sohu.com。