電化學發光免疫測定25-羥基維生素D3在疾病預防控制中心的應用*

(北京市疾病預防控制中心，北京 100013)

李　紅，沙怡梅，趙　耀△，施嘉琛

(北京市疾病預防控制中心，北京 100013)

?

·臨床研究·

電化學發光免疫測定25-羥基維生素D3在疾病預防控制中心的應用*

(北京市疾病預防控制中心，北京 100013)

李紅，沙怡梅，趙耀△，施嘉琛

(北京市疾病預防控制中心，北京 100013)

摘要:目的在疾病預防控制中心使用電化學發光免疫分析儀測定血清中25-羥基維生素D3。方法使用E-170電化學發光免疫分析儀測定25-羥基維生素D3并與使用酶免檢測的數據進行比較。結果E-170電化學發光免疫分析儀測定25-羥基維生素D3質控血清檢測結果均在1個標準差內；與酶免檢測數據比較差異有統計學意義(P<0.05)，相關性差(r=0.568)。結論25-羥基維生素D3室內質控結果良好，可以使用E-170電化學發光免疫分析儀在疾病預防控制中心開展25-羥基維生素D3的檢測工作，兩種方法檢測結果差異較大，在進行干預比較性實驗時要注意使用的檢測方法。

關鍵詞:電化學發光免疫測定；25-羥基維生素D3；比對實驗

維生素D是一種脂溶性維生素，最重要的兩個形式是維生素D3(膽鈣化甾醇)和維生素D2(麥角鈣化甾醇)[1]。維生素D是脂溶性甾體激素前體，其本身并沒有生物活性，在體內肝臟和腎臟經過連續兩步的羥基化反應過程變成為具有生物活性的1,25-二羥基維生素D[2]。檢測血清中25-羥基維生素D有95%以上的為25-羥基維生素D3，當服用維生素D2補充劑時可達到25-羥基維生素D2檢測水平。在人體內循環中的25-羥基維生素D的半衰期為2～3周，維生素D的水平和人體健康息息相關，與兒童佝僂病、骨質疏松癥、帕金森病、心血管疾病、高血壓、慢性腎臟病、2型糖尿病、干燥綜合征、過敏性鼻炎、腫瘤等疾病的研究大量被報道[3-12]。觀察不同緯度陽光照射、營養狀況等因素對人體維生素D水平的影響，通過改善生活習慣、飲食結構從而使維生素D水平達到正常。在以往的檢測工作中酶免方法使用較多，使用E-170電化學發光免疫分析儀在疾病預防控制中心開展25-羥基維生素D3檢測。

1材料與方法

1.1儀器設備E-170電化學發光免疫分析儀,羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.2試劑、校準品和質控品E-170電化學發光免疫分析儀配套使用試劑、標準品和質控品由羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.2.2校準品和質控品25-羥基維生素D3校準品貨號03314855， 4×1 mL。質控品貨號11972227，水平1和2各有(2×2)mL。

1.2.3系統附件系統緩沖液ProCell M，(2×2)L，貨號04880340。檢測池清洗液CleanCell M，(2×2)L，貨號04880293。貨號03023141，PC/CC-Cups，12杯，使用前預熱ProCell M和CleanCell M。貨號03005712，ProbeWash M,12×70 mL洗液，用于更換試劑和檢測完畢后的沖洗。貨號12102137，48盒×84反應器或移液頭，廢物袋。

1.3檢測原理25-羥基維生素D3檢測試劑盒使用的是抗維生素D3多克隆抗體，采用競爭法，樣品總檢測時間為18 min。反應過程需要進行兩次孵育，首先灰色蓋R1生物素標記的維生素D與血清(35 μL)中的維生素D3發生競爭反應，黑色蓋R2生物素-維生素D/釕復合物標記的多克隆特異性維生素D3抗體復合物與該生物素標記的維生素D結合。反應體系中免疫復合物的剩余量和樣本中分析物的濃度有關。第2次孵育是在體系中添加透明蓋M鏈霉親和素包被的微粒后，生物素與鏈霉親和素的相互作用使形成的免疫復合體結合到固相。將反應混合物吸入測量池，通過磁性微粒吸附到電極表面。加入ProCell系統緩沖液將沒有結合物質除去。對電極加壓之后產生化學發光，光電倍增器開始測定發光的強度計算樣品結果。

1.4實驗方法將試劑組放入E-170分析儀試劑倉(20 ℃)，通過試劑條碼儀器自動讀取測試具體參數。定標：25-羥基維生素D3試劑組帶有一個含有各批號試劑定標具體信息的條碼標簽，使預定義的主曲線適用于分析儀。質控：檢測質控血清水平1和2進行室內質量控制，質控血清檢測結果符合要求后檢測標本。計算：根據在分析儀上2點定標產生的定標曲線和試劑條碼提供的主曲線判定，分析儀自動計算出各樣本中被測物濃度(ng/mL或nmol/L)。實驗檢測數據使用ng/mL濃度單位。換算因子：nmol/L×0.40=ng/mL；ng/mL×2.50=nmol/L。

1.5統計學處理采用SPSS16.0軟件包進行統計學分析，實驗數據進行t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1E-170電化學發光免疫分析儀上質控品檢測結果見表1。

表1　質控品檢測結果(ng/mL)

2.2相關性分析兩種檢測方法結果比較差異有統計學意義(P=0.00，t=6.885),相關性差(r=0.568)，檢測結果見表2。

表2　兩種方法結果比較(n=256,ng/mL)

3討論

兩個水平的質控品檢測結果均在1個標準差內，結果良好符合要求。使用前分析儀器會自動對磁性微粒進行再混勻，不同濃度范圍的質控品單獨測定，至少要在開始測試后每24 h一次、每個試劑盒一次和在每次定標后一次。制訂實驗室的質控間隔和限值,所檢測值應在規定的限值內。另外，試劑說明書指出該方法的溯源性，本方法已經過LC-MS-MS法標準化，可以使用E-170電化學發光免疫分析儀開展25-羥基維生素D3的檢測工作。與酶免檢測數據比對結果差別有統計學意義，這與張弘等[13]報道的一致。美國臨床實驗室標準協會(CLSI)EP9-A2文件的要求是r≥0．975(或r2≥0.95)[14]，兩種檢測方法相關性差(r=0.568)。目前國內檢測維生素D的方法并不統一，結果有很大差異[15-19]。在疾病預防控制中心或者婦幼保健院等根據營養狀況監測并進行補充改善的工作[20]，在進行干預前后、進行比較性實驗時要注意使用的檢測方法。

E-170電化學發光免疫分析儀配套使用試劑M(透明蓋)、R1(灰色蓋)、R2(黑色蓋)組成25-羥基維生素D3試劑組，豎直存放于2～8 ℃冰箱保存，以確保使用前自動混合過程中微粒完全有效。輕拿輕放避免試劑起泡。為了避免因試劑瓶蓋過緊在操作時錯誤報警，在放入試劑倉之前可手工分別把3瓶試劑蓋輕輕打開再輕輕合上。儀器設備試劑盤內溫度為20 ℃左右，為了保證試劑穩定性檢測之前放入，不能長期放在試劑倉內。為了避免運行過程中異常停機，開機之前準備好系統試劑及倒掉廢棄物，并且按照醫療廢棄物嚴格處理。

在試劑說明書中還有一些內容需要注意，檢測25-羥基維生素D3標本使用帶分離凝膠的血清：在18～25 ℃穩定8 h，2～8 ℃能穩定4 d，-20 ℃可穩定6個月。K3-EDTA抗凝血漿：18～25 ℃可以穩定8 h，2～8 ℃穩定4 d，-20 ℃穩定6個月。肝素-鋰抗凝血漿：18～25 ℃能穩定8 h，2～8 ℃穩定1 d，肝素-鋰抗凝的血漿禁止冷凍。試劑檢測范圍：4～100 ng/mL或者10～250 nmol/L。低于檢測下限時報告值為小于4 ng/mL(<10 nmol/L)。超出測量范圍上限時報告值為大于100 ng/mL(>250 nmol/L)，超出測量范圍的樣本可進行人工稀釋后在測定。在開展檢測工作之前認真仔細閱讀試劑說明書對保證檢測結果的準確是很必要的。

參考文獻

[1]蔭士安．維生素D與人體健康關系[J]．醫學動物防制，2014，30(10)：1104-1111.

[2]張秀明，李建齋，魏明竟，等．現代臨床生化檢驗學[M].北京：人民軍區出版社，2003：709．

[3]陳治卿．維生素閱與人體健康[J]．中國骨質疏松雜志，2013，19(1)：93-96.

[4]劉晶，周旭平，羅蔚鋒，等．血清維生素D與帕金森病關系的研究進展[J]．中華神經醫學雜志，2015，14(2)：211-214.

[5]戴晨光，李學奇．維生素D與心血管疾病關系的研究進展[J]．微循環學雜志，2015，25(1)：62-66.

[6]張棟武，陳立新，區大剛，等．維生素D與高血壓關系的臨床研究[J]．中國基層醫藥，2015，22(1)：51-53.

[7]張倩，陳靖．維生素D與慢性腎臟病患者的免疫調節功能[J]．腎臟病與透析腎移植雜志，2015，24(2)：156-159.

[8]王春曉，沈旭慧，王珍．維生素D與2型糖尿病的關系[J]．生理科學進展，2015，46(2)：121-125.

[9]陳嘉利，蔡玉英．干燥綜合征患者血清維生素D 的相關性研究[J]．醫學檢驗與臨床，2015，26(2)：18-19.

[10]吳文奇，梁燕明，林德健．過敏性鼻炎患者血清維生素D水平的臨床研究[J]．廣州醫藥，2015，46(1)：84-85.

[11]馬良，徐延鈞，楊建洲，等．血漿維生素D水平與食管鱗癌發生的關系[J]．中華內科雜志，2015，54(1)：50-51.

[12]姜烈君，黃華藝．血清維生素D與腫瘤的關系及其檢測方法的研究進展[J]．中國臨床新醫學，2014，7(10)：986-989.

[13]張弘，陳善昌．根據CLSIEP9A2評價電化學發光法和酶聯免疫法檢測25-羥基維生素D的一致性[J]．廣西醫科大學學報，2012，29(2)：251-253.

[14]National Committee for Clinical Laboratory Standards．EP9-A2 Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples [S]．Second Edition.Wayne，PA：NCCLS，2002．

[15]姜麗，李波，李洋，等．維生素D實驗室檢測方法研究進展[J]．國際檢驗醫學雜志，2012，33(17)：2116-2117.

[16]游春華，熊筱娟，王清華，等．維生素D受體基因的多態性與檢測方法[J]．藥學實踐雜志，2014，32(5)：329-331.

[17]曾義．高效液相色譜-質譜法檢測血清中維生素D含量[J]．中國藥業，2013，22(20)：17-18.

[18]程雅婷，董衡，梁曉翠，等．人血清中25 羥基維生素D 測定的兩種質譜方法比較[J]．中華臨床醫師雜志，2013，7(14)：6535-6542.

[19]李水軍，王思合，周建烈，等．維生素D代謝及25-羥基維生素D測定方法研究進展[J]．國際檢驗醫學雜志，2012，33(24)：3028-3030.

[20]孫錦宏，白濤，董進宇．青春期前兒童維生素D營養狀況監測及補充對策[J]．國際檢驗醫學雜志，2015，36(4)：554-555.

(收稿日期：2016-01-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.039

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1247-03

*基金項目：衛生公益性行業科研專項(201202012)。△通訊作者，E-mail：zhaoyao@bjcdc.org。