水稻編碼SAND結構域基因的序列與功能初步分析

陳志雄,戴雙鳳,夏昌選,謝海媚,李亞娟

(1.華南農業大學 農學院,廣東 廣州　510642;2.華南農業大學公共基礎課實驗教學中心,廣東 廣州　510642)

?

水稻編碼SAND結構域基因的序列與功能初步分析

陳志雄1,戴雙鳳1,夏昌選1,謝海媚1,李亞娟2

(1.華南農業大學 農學院,廣東 廣州510642;2.華南農業大學公共基礎課實驗教學中心,廣東 廣州510642)

摘要：為研究水稻SAND結構域蛋白的序列和功能，利用Blast在水稻基因組中搜索編碼SAND結構域的基因，然后構建增強表達載體并通過遺傳轉化研究基因功能。結果表明，水稻基因LOC_Os01g57240(命名為OsULT1)編碼的氨基酸序列含有SAND結構域和ULT B-box共有序列，與其他植物ULT氨基酸序列相似性為49.3%～92.3%，具有較好的保守性；35S::OsULT1轉基因株系部分穎花發育異常，出現內稃發育滯緩或退化、漿片過度發育或數目變多、雄蕊數目3～7枚、雌蕊2枚的現象；穎花內產生多余的小花，表明OsULT1對水稻花分生組織正常分化具有重要的調控作用。

關鍵詞：水稻;花發育;SAND結構域;基因;序列

植物花的發育是按一定的步驟進行的,首先在光周期促進、春化促進、自動調控和赤霉素4種途徑共同調控下[1],完成從營養生長向生殖生長的轉換,這時一部分或全部的莖頂端分生組織形成花序分生組織原基。隨后花序分生組織的周邊區域發育形成花分生組織和花器官分生組織原基,最終形成花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊四輪不同類型的花器官。擬南芥花器官分生組織基因主要有A類基因APETALA1(AP1)和AP2、B類基因AP3和PISTILLATA(PI)、C類功能基因AGAMOUS(AG),這3類基因單獨或共同調控花器官原基的產生[2]。E類基因SEP1、SEP2和SEP3冗余作用決定花瓣、雄蕊和心皮以及花的有限發育[3-4]。除了AP2外,ABCE類基因編碼植物特有的MADS-box蛋白,具有保守的MIKC結構域,能形成二聚體或高層次的復合體[5]。擬南芥MADS-box基因編碼的蛋白所形成的復合體能夠將葉片轉變為花器官[6]。因此,花發育的四復合體模型認為AP1-AP1-X-X、AP1-AP3-PI-SEP、AP3-PI-AG-SEP和AG-AG-SEP-SEP MADS-box蛋白的復合體分別為目標基因特異性結合基因,決定了相應花器官的形成[4]。

水稻花形態特征特異,花發育過程中各分生組織的許多特征與雙子葉植物明顯不同,是研究單子葉植物花發育的模式材料。水稻花發育的基因調控研究已取得了一定進展,調控不同階段花發育相關基因均有報道,如TETFL1的同源基因RCN1和RCN2、LFY的同源基因APO2/RFL、調控水稻枝梗和小穗分生組織發育相關的基因有SP1、DEP2、OsAPO1/SCM2、IPA1、TAW1、LAX、LOG1和參與調控小穗分生組織發育及小穗向小花分生組織過渡的基因有FZP、SNB和MSF1[7-8]。水稻基因組中存在與擬南芥同源的花器官分生組織特異基因,如A類基因OsMADS14和OMADS15、B類基因SPW1/OsMADS16、OsMADS2和OsMADS4、C類基因OsMADS3、OsMADS58和DL、E類基因LSH1/OsMADS1[9-10]。水稻花發育調控基因在功能上與擬南芥具有保守性,但也出現一定的分化。

植物花發育是一個涉及眾多基因相互協調、共同調控的復雜過程。花發育過程的花分生組織形態特征異常往往導致花器官數目變異,如擬南芥wuschel(wus)突變體花分生組織變成有限性分化[11]、perianthia突變體花分生組織大小未變但花器官空間分布的變化[12]、花分生組織大小,如clavata1、2、3和wiggum突變體[13-14]。花分生組織大小對花器官數目的調控機理研究最清楚的是擬南芥的CLV信號途徑[13]。水稻中存在著類似擬南芥的CLV信號途徑,水稻FON1是CLV1的同源基因,控制了花分生組織的大小。FON4對分生組織的正常終止是必需的,FON4屬于CLV3/ESR相關的基因家族[7-8]。擬南芥ultrapetala1(ult1)突變體花序分生組織變大,產生多余的花和花器官,花分生組織有限性缺失,AtULT1編碼SADN結構域蛋白,通過WUS-AG空間反饋環,負調控WUS基因活性進而影響花分生組分化有限性,是莖端分生組織和花分生組織細胞積累的負調控因子[15-16]。本研究利用AtULT1序列搜索水稻基因組序列發現了一個同源基因ULTRAPETALA1(OsULT1),首先分析了OsULT1的氨基酸序列,并且構建OsULT1增強表達載體,通過農桿菌介導法轉化栽培稻,觀察轉基因株系的花器官變異情況,旨在初步明確OsULT1對花器官發育的影響,充實水稻生殖發育的分子調控機制。

1材料和方法

1.1序列分析

利用擬南芥ULTRAPETALA1(AtULT1)基因序列在水稻基因組注釋項目(http://rice.plantbiology.msu.edu/)進行Blast,選E-value 小于e-10的記錄進行分析。并選用AtULT1氨基酸序列在 phytozome(http://www.phytozome.net)進行BlastP,獲取同源基因。利用PROSITE(http://prosite.expasy.org/)預測蛋白質結構域。在水稻全長cDNA數據庫KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)搜索到全長cDNA。序列比對和系統進化樹構建分別采用ClustalX 1.83和MEGA 5.2軟件。

1.2總RNA提取與RT-PCR

取水稻日本晴孕穗期幼穗,利用TRIzol法(Invitrogen公司)提取總RNA。采用SuperScript RTⅡ逆轉錄酶(Invitrogen公司)將RNA逆轉錄成第一鏈,離心管中加入5 μg總RNA和1 μL Oligo(dT)15(Promega公司),補充一定體積DEPC水到8 μL。在70 ℃水浴中加熱5 min,后在冰上冷卻,稍離心。然后依次加入4 μL 5× First Strand Buffer(Invitrogen公司)、2 μL 0.1 mol/L DTT(Invitrogen公司)、1.6 μL 2.5 mmol/L DNTP(TaKaRa公司)和1 μL Rasin(40 U/μL)(Promega公司),混勻后42 ℃反應2 min;加1 μL逆轉錄酶SuperScript RTⅡ,42 ℃反應1 h,70 ℃反應15 min,終止反應。

RT-PCR以逆轉錄的cDNA為模板,擴增體系為20 μL,內含2.0 μL cDNA、2.0 μL 10× PCR Buffer、0.8 μL 2.5 mmol/L dNTP、4.0 μL 引物(1.0 μmol/L)、0.2 μLTaq酶(5 U/μL)和11 μL ddH2O。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min;94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s,循環28次;72 ℃ 10 min(延伸)。OsULT1基因特異性引物為OsULT1-F(5′-TTATTTTGA GTTGTTGCGGTGTG-3′)和OsULT1-R(5′-CGGGGA ATCATTGGACCTG-3′)。潮霉素基因引物Hpt-F(5′-TCCGGAGCCTCCGCTCGAAGTAG-3′)和Hpt-R(5′-CTGAACTCACCGCGACGTCGTC-3′)。

1.3PCR產物回收和克隆及測序

利用0.8%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增的產物,并割膠回收目的DNA片段,用于連接反應。連接反應體系為PCR產物5 μL,pUCm-T載體0.5 μL(25 ng),T4連接酶1 μL(4 U),10×T4連接酶緩沖液2 μL,ddH2O 11.5 μL,反應總體積20 μL,14 ℃過夜。取5～10 μL連接產物,加入到100 μL感受態DH-5α菌株的細胞懸浮液中,混勻,置冰上30 min,42 ℃熱擊90 s,冰上3～5 min。加入0.5 mL的LB培養液,37 ℃振蕩培養1 h。取100 μL培養液涂布于LB培養平板上,37 ℃培養到藍白斑區分明顯。挑選白色菌落,37 ℃振蕩培養12 h。用堿裂解法抽提質粒,送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序

1.4轉基因試驗與表型分析

構建了35S::OsULT1增強表達轉基因質粒,設計引物PCR擴增OsULT1 cDNA編碼區序列,克隆到pUCm-T載體上,雙酶切后,連接到pCAMBIA1301的多克隆位點。水稻遺傳轉化采用農桿菌介導法[17]。水稻稻穗破口時,選取幼穗,觀察內外稃片數、漿片、花藥、柱頭和子房的數目,并選擇含有不同數目花器官典型的小花進行拍照。

2結果與分析

2.1水稻ULTRAPETALA1的序列獲取

以擬南芥ULTRAPETALA1(AtULT1)基因編碼區序列Blast水稻基因組注釋項目(TIGR),獲得2個E-value 小于e-10的記錄號,分別為LOC_Os01g57240和LOC_Os05g42290。PROSITE預測結果表明,LOC_Os01g57240編碼的氨基酸序列含有SAND結構域;在水稻全長cDNA數據庫搜索到與LOC_Os01g57240編碼區相匹配的全長cDNA AK064375,編碼區序列相似性達99%,僅有2個堿基的差異,表明LOC_Os01g57240基因能轉錄形成mRNA,將它命名為OsULT1。LOC_Os05g42290編碼的氨基酸序列不具有SAND結構域,在水稻全長cDNA數據庫發現了與它編碼區相匹配的全長cDNA AK108614,但兩者相似性較差,LOC_Os05g42290不作后續分析。

2.2水稻ULTRAPETALA1的序列比對與進化分析

利用OsULT1氨基酸序列在 Phytozome(http://www.phytozome.net)進行BlastP,結果發現雙子葉植物擬南芥、苜蓿、大豆和單子葉植物玉米、二穗短柄草、谷子基因組有水稻OsULT1同源基因,具有較好的保守性,編碼的氨基酸序列中含有SAND結構域和ULT B-box共有序列(圖1);這8種植物ULT氨基酸序列相似性較高,為49.3%～92.3%。水稻OsULT1與GmULT序列相似性最低為54.6%,而與SiULT的相似性最高達87.6%。

OsULT1.LOC_Os01g57240，水稻;ZmULT.GRMZM2G082745,玉米;SiULT.Si002762m,谷子;BdULT.Bradi2g51790,

擬南芥AtULT1和AtULT2 SADN結構域堿基序列發生錯義突變,導致花序和花分生組織變大而產生多余的花或花器官。將植物ULT蛋白SAND結構域序列與人類、繡麗隱桿線蟲的ULT蛋白SAND結構域序列進行多序列比對,發現它們之間的保守性較差,相似性為9.9%～20.2%,而植物SAND結構域序列之間相似性則較高,相似性為47.2%～84.6%,但是2個重要的基序TPxxFE和KDWK均存在,二級結構也存在較大的差異(圖2)。系統進化樹分析表明,植物ULT蛋白與人類、繡麗隱桿線蟲的ULT蛋白明顯分成兩大類,進化關系較遠,而植物間則相對較近(圖3)。

OsULT1.LOC_Os01g57240,水稻;SiULT.Si002762m,谷子;BdULT.Bradi2g51790,二穗短柄草;MtULT.AC229695_4,苜蓿;PtULT.

圖3　水稻OsULT1與其他物種

2.3水稻ULTRAPETALA1基因的功能研究

據OsULT1基因全長cDNA AK064375克隆序列設計特異性引物擴增CDS序列并測序,結果表明,擴增條帶的序列與預測的一樣。將OsULT1 CDS插入pCAMBIA1301多克隆位點,構建了OsULT1超表達載體35S::OsULT1,通過農桿菌介導法進行遺傳轉化粳稻品種日本晴,并獲得轉基因株系,利用pCAMBIA1301載體攜帶的潮霉素基因設計特異性引物,進行PCR擴增檢測,表明35S::OsULT1整合到日本晴基因組(圖4-A)。RT-PCR檢測結果表明轉基因株系OsULT1基因的表達量大于對照日本晴(圖4-B)。

轉基因株系株營養生長期植株形態與野生型水稻類似,莖稈、葉片、葉鞘形態未表現出變異。抽穗期,幼穗頂端部分小穗表現出變異(圖5)。正常水稻穎花由4輪花器官組成,從外到內依次為外稃、內稃各1片、1對漿片、6枚雄蕊和1枚雌蕊,穎花的基部有1對退化的護穎。轉基因株系35S::OsULT1小穗表現花器官結構,如小穗軸上長一穎花和一稃片狀結構(圖5-A)、內稃退化成尖狀結構(圖5-B)、外稃包住內稃(圖5-C)、外稃與內稃之間有漿片狀結構(圖5-C1)、內稃里長有雄蕊和雌蕊(圖5-C2)、外稃包住另一完整的小花(圖5-D、D1、D2)、穎花的內、外稃內長有類稃片結構1或2片(圖5-E～F)等,有的花絲頂端發育出柱頭(圖5-G),有的內稃發育帶緩或退化(圖5-H～J)。轉基因株系35S::OsULT1產生2對漿片的穎花(圖5-K)，漿片過度發育與花絲相粘連(圖5-L)。轉基因株系35S::OsULT1雌蕊異常表現為2枚雌蕊(圖5-K)。轉基因株系35S::OsULT1穎花內花藥數變化較大，有3枚(圖5-K)、4枚(圖5-M)、5枚(圖5-N)、6枚(圖5-O)、7枚(圖5-P)；穎花內花絲花藥粘連在一起(圖5-Q)。這些變異性狀在轉基因株系后代均可觀察到,表明OsULT1表達水平變異會影響水稻花分生組織正常分化。

A：1.DL2000 標準分子;2,3.日本晴;4～10.T0轉基因株系;

圖5　35S::OsULT1轉基因株系花器官變異

3討論與結論

水稻作為重要糧食作物之一,其生殖發育(花序)影響與稻谷產量緊密相關,研究水稻生殖發育機制具有重要的理論意義和實踐價值。與雙子葉模式植物相比,水稻等單子葉植物花序發育的機制研究明顯落后于雙子葉植物,相關突變體較少是原因之一。反向遺傳學方法是研究水稻花發育的基因調控機制的有效方法[10]。擬南芥AtULT1在花序、花分生組織大小以及維系花分生組織有限性的負調控中發揮著重要的作用[15-16],擬南芥AtULT1和AtULT2表達水平下調導致側生器官發育畸形和早期莖端分生組織分化停止[18],可見擬南芥ULT基因在花發育中的重要性。本研究結果表明,水稻基因組存在一個ULT基因OsULT1,其編碼的蛋白質含有SAND結構和TPxxFE基序。DmDEAF-1、HsNUDR和HsGMEB1/2等SAND 結構蛋白與DNA特異性結合,SAND結構域通過KDWK基序調控這種相互作用,SAND結構域是AIRE反式激活、同質多聚化和核定位所必需的。三維結構模型分析SAND結構域是一新的DNA結合分子,參與基因轉錄調控[19]。擬南芥AtULT1與 ATX1 trxG因子相互作用,影響AGAMOUS組蛋白甲基化調控AGAMOUS的轉錄水平[20]。水稻OsULT1與擬南芥AtULT1的SAND結構序列相似為67.3%,預示著水稻OsULT1具有與AtULT1類似的功能,在花發育過程中發揮調控作用。

轉基因株系35S::OsULT1少數穎花四輪花器官數目均表現變異,轉基因株系后代表現類似的變異性狀,表明OsULT1表達水平變異會影響水稻花分生組織正常分化。35S::OsULT1轉基因株系大部分穎花的花器官未出現變異,這可能與轉基因株系中OsULT1表達水平增加較小有關。單子葉水稻花發育模型與雙子葉植物相似,水稻C類功能基因有OsMADS3和OsMADS58,SEP類功能基因LSH1/OsMADS1等,這些基因發生變異會導致花器官數目、同源異型轉化和花分生組織分化有限性發生變化。水稻中也存在著類似擬南芥的CLV信號途徑。水稻FON1和FON4分別是擬南芥CLV1和CLV3/ESRLRR同源基因,FON1 控制了花分生組織的大小,FON4對分生組織的正常終止是必需的,表型上的相似性暗示FON1與FON4 在控制分生組織發育的通路中共同起作用,因此,有必要進一步探討ULT1與它們之間的調控關系。

參考文獻：

[1]Jaeger K E,Pullen N,Lamzin S,et al.Interlocking feedback loops govern the dynamic behavior of the floral transition inArabidopsis[J].Plant Cell,2013,25(3):820-833.

[2]Stewart D,Graciet E,Wellmer F.Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development[J].FEBS Journal,2016,doi:10.1111/febs.13640.

[3]Goto K,Kyozuka J,Bowman J L.Turning floral organs into leaves,leaves into floral organs[J].Curr Opin Genet Dev,2001,11(4):449-456.

[5]Immink R G,Gadella T W Jr,Ferrario S,et al.Analysis of MADS box protein-protein interactions in living plant cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(4):2416-2421.

[6]Honma T,Goto K.Complexes of MADS-box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs[J].Nature,2001,409(6819):525-529.

[7]張亞芳,左示敏,陳宗祥,等.水稻花序發育的分子調控研究進展[J].江蘇農業科學,2014,42(11)：4-8.

[8]盧寰,時振英.水稻穗發育的分子生物學研究進展[J].植物生理學報,2013,49(2)： 111-121.

[9]Zhang D B,Yuan Z.Molecular control of grass inflorescence development[J].Annu Rev Plant Biol,2014,65:553-578.

[10]于新,王建軍,王才林.水稻花器官發育的分子機理[J].分子植物育種,2013,11(4)：617-624.

[11]Laux T,Mayer K F,Berger J,et al.TheWUSCHELgene is required for shoot and floral meristem integrity inArabidopsis[J].Development,1996,122(1):87-96.

[12]Running M P,Meyerowitz E M.Mutations in thePERIANTHIAgene ofArabidopsisspecifically alter floral organ number and initiation pattern[J].Development,1996,122(4):1261-1269.

[13]Clark S E,Running M P,Meyerowitz E M.CLAVATA1,a regulator of meristem and flower development inArabidopsis[J].Development,1993,119(2):397-418.

[14]Running M P,Fletcher J C,Meyerowitz E M.TheWIGGUMgene is required for proper regulation of floral meristem size inArabidopsis[J].Development,1998,125(14):2545-2553.

[15]Carles C C,Lertpiriyapong K,Reville K,et al.TheULTRAPETALA1 gene functions early inArabidopsisdevelopment to restrict shoot apical meristem activity,and acts throughWUSCHELto regulate floral meristem determinacy[J].Genetics,2004,167(4):1893-1903.

[16]Engelhorn J,Moreau F,Fletcher J C,et al.ULTRAPETALA1 andLEAFYpathways function independently in specifying identity and determinacy at theArabidopsisfloral meristem[J].Ann Bot,2014,114(7):1497-1505

[17]Hiei Y,Ohta S,Komari T,et al.Efficient transformation of rice (OryzasativaL.) mediated byAgrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].The Plant Journal,1994,6(2):271-282.

[18]Monfared M M,Carles C C,Rossignol P,et al.TheULT1 andULT2 trxG genes play overlapping roles in Arabidopsis development and gene regulation[J].Mol Plant,2013,6(5):1564-1579.

[19]Bottomley M J,Collard M W,Huggenvik J I,et al.The SAND domain structure defines a novel DNA binding fold in transcriptional regulation[J].Nature Structural Biology,2001,8(7):626-633.

[20]Pires H R,Shemyakina E A,Fletcher J C.TheULTRAPETALA1 trxG factor contributes to patterning theArabidopsisadaxial-abaxial leaf polarity axis[J].Plant Signal Behav,2015,10(7):e1034422.

Preliminary Analysis on Sequence and Function of Rice Gene Encoding SAND-domain Protein

CHEN Zhixiong1,DAI Shuangfeng1,XIA Changxuan1,XIE Haimei1,LI Yajuan2

(1.College of Agronomy,South China Agricultural University,Guangzhou510642,China;2.Center of Experimental Teaching for Common Basic Courses,South China Agricultural University,Guangzhou510642,China)

Abstract：To study the sequence and function of rice SAND domain protein,the gene encoding SAND was identified by Blast against the rice genome,and then over-expression vector was constructed to study its gene function by genetic transformation.The results found that the rice genome contains a gene LOC_Os01g57240(named as OsULT1),which encoded amino acid sequence containing SAND domain and ULT B-box consensus sequence.The amino acid sequence similarity between OsULT1 and ULTs of other plants varied from 49.3% to 92.3%, they were highly conservative.The 35S::OsULT1 transgenic lines generated some mutant spikilets,which included under-developed or degenerated paleas,over-developed locidules,the increased number of locidules,the variant number of stamen,two pistils,or extra floret.The results indicates OsULT1 should play important roles in regulation of floral meristem identity in rice.

Key words:Rice(Oryza sativa L.);Floral development;SAND-domain;Gene;Sequence

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.001

中圖分類號：S511.03;Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0001-06

作者簡介：陳志雄(1975-),男,福建莆田人,副研究員,博士,主要從事水稻分子遺傳與種質創新研究。通訊作者：李亞娟(1979-),女,山東菏澤人,高級實驗師,博士,主要從事水稻生殖遺傳學研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(31271688);廣東省自然科學基金項目(S2011010005114)

收稿日期：2016-02-01