豬博卡病毒不同基因型三重PCR檢測方法的建立及初步應用

宏春慧,楊　兵,覃湘婕,周宏專,徐福洲,蘇　霞,薛　靜,張曉東,王金洛

(1.北京農學院 動物科學技術學院,北京　102206;2.北京市農林科學院 畜牧獸醫研究所,畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室,北京　100097;3.北京農業生物技術研究中心,北京　100097)

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豬博卡病毒不同基因型三重PCR檢測方法的建立及初步應用

宏春慧1,2,3,楊兵2,覃湘婕2,周宏專2,徐福洲2,蘇霞2,薛靜3,張曉東3,王金洛2

(1.北京農學院 動物科學技術學院,北京102206;2.北京市農林科學院 畜牧獸醫研究所,畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室,北京100097;3.北京農業生物技術研究中心,北京100097)

摘要：為鑒別豬博卡病毒1型、2型和3型3種基因型,根據豬博卡病毒基因序列分別設計3對針對保守區域的引物進行PCR擴增,擴增目的片段大小分別為645 bp (PBoV1型)、352 bp(PBoV2型)和259 bp(PBoV3型)。通過引物濃度和退火溫度等條件優化,首次建立了同時檢測豬博卡病毒3種基因型的三重PCR方法。所建立的三重PCR方法擴增其他豬病病毒結果均為陰性,最低檢測限為8×10-7ng/μL。結果表明，該方法具有較好的特異性和敏感性。對臨床樣品進行三重PCR和單項PCR檢測,對比結果顯示符合率為100%。該方法的建立為豬博卡病毒3種不同基因型的鑒別檢測提供了有效手段。

關鍵詞：豬博卡病毒;基因型;三重PCR;檢測

博卡病毒(Bocavirus)為細小病毒科、細小病毒亞科、博卡病毒屬的成員。豬博卡病毒(Porcinebocavirus,PBoV)是2009年在患有仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征的豬淋巴結中,通過隨機置換擴增的方法和高通量測序技術在瑞典首次發現[1]。由于對PBoV的研究仍處于起步階段,其單獨的致病性仍未見報道,則有報道認為其與患斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)、仔豬腹瀉等疾病相關[2-3]。臨床上,該病毒也可能與其他病原混合感染[4-5],進而造成更嚴重的經濟損失。

PBoV基因組大小在5.2 kb左右,為無囊膜的單股線狀DNA病毒[6]。PBoV除了與細小病毒科其他成員共有2個開放閱讀框外(編碼非結構性蛋白NS1的ORF1和編碼重疊的衣殼蛋白VP1和VP2的ORF2),其在非結構性和結構性編碼區之中有第3個博卡病毒特征性的開放閱讀框ORF3,編碼一個高度磷酸化的非結構性蛋白質NP1[7-8]。

研究人員起初按照病毒發現時間的先后順序,根據ICTV(International Committee on Taxonomy of Viruses,http://www.ictvdb.org/)的分類標準,當NS1基因的核苷酸同源性低于95%時,則定義為不同的基因型[4]。近年來,新的序列甚至新的基因型不斷被發現,研究人員通過對基因組序列及NS1/VP1/NP1基因序列遺傳進化分析發現,豬博卡病毒屬總能出現明顯的3個聚簇,根據發現的先后順序,研究人員將這些聚簇定為3個型:PBoV1、PBoV2和PBoV3[9-10]。

由于PBoV基因型眾多,給臨床檢測帶來一定困難。目前,檢測PBoV的方法主要有PCR檢測[11-13],實時熒光定量PCR檢測[14-15]、環介導等溫擴增檢測(LAMP)[16]及ELISA檢測[17]等,但未見能同時檢測區分PboV 3種不同基因型研究的報道。本研究根據GenBank公布的PBoV1、PBoV2和PBoV3 3種基因型參考序列的特征,在同源性分析的基礎上,找出保守區,進而設計引物,并優化反應條件,建立了一種可以同時檢測3種PBoV基因型的方法,可以同時檢測出PBoV的單獨或混合感染,為臨床檢測提供了新的技術手段。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1試劑2×Es Taq MasterMix購自康為世紀生物制品有限公司。質粒提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒、Top10感受態細胞、病毒DNA/RNA提取試劑盒和細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。DL2000 DNA Marker 購自TaKaRa有限公司。RNeasy Mini Kit購自QIAGEN公司。GoldScript cDNA合成試劑盒購自Invitrogen公司。

1.1.2陽性質粒、病毒與臨床樣品分別含有PBoV1、PBoV2和PBoV3型VP1蛋白編碼片段的陽性質粒pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3由畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室構建保存。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬庫布病毒(PKoV)、豬圓環病毒(PCV)和偽狂犬病毒(PRV)的cDNA/DNA樣品和大腸桿菌(E.coli)K88由本實驗室制備保存。豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)三聯活疫苗購自哈爾濱維科生物技術開發公司。豬瘟活疫苗(細胞源)購自上海海利生物技術股份有限公司。臨床糞便樣品來源于2015年2-8月京津冀地區的部分腹瀉豬場。

1.2試驗方法

1.2.1引物的設計與合成根據GenBank上公布的PBoV相關的序列信息(表1),利用Lasergene軟件套裝中的Megalign軟件,分析不同型PBoV的保守區,在病毒保守區分析的基礎之上,利用Oligo 7軟件設計簡并引物(表2),并由Invitrogen 公司合成。

表1　本試驗參考的PBoV序列

表2　本試驗所用的引物

注:引物位置分別對應序列PBoV1(HQ291308)、PBoV2(HQ291309)和PBoV3(JF713714)。

Note:Positions correspond to PBoV1(HQ291308),PBoV2(HQ291309)and PBoV3(JF713714).

1.2.2標準品的制備將含有PBoV1、PBoV2和PBoV3型VP1蛋白編碼片段的陽性質粒pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3,用核酸分析儀檢測濃度。根據濃度測定結果,將3種質粒用ddH2O稀釋至濃度為20 ng/μL,再將其等量混合即為質粒標準品。1.2.3反應條件的優化本試驗建立的PCR反應體系為25 μL,其中加入2×Es Taq Master Mix 12.5 μL,pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3陽性混合質粒模板3 μL,引物的起始濃度均為10 μmol/L,引物體積為0.5～2 μL調整,PBoV1/PBoV2/PBoV3引物量(10 μmol/L)選擇如下8種組合:0.5 μL/0.5 μL/1.5 μL、0.5 μL/0.5 μL/2 μL、0.5 μL/1 μL/1.5 μL、0.5 μL/1 μL/2 μL、1 μL/0.5 μL/1.5 μL、1 μL/0.5 μL/2 μL、1 μL/1 μL/1.5 μL和1 μL/1 μL/2 μL,以確定最適宜的引物體積。在最佳引物量確定的基礎上,進一步優化反應的退火溫度,退火溫度選擇在48～60 ℃內進行優化,以確定最適宜的退火溫度。

1.2.4特異性試驗豬輪狀病毒(RV)樣品和豬瘟病毒(SFV)樣品RNA分別來源于豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)三聯活疫苗和豬瘟活疫苗(細胞源),并按RNeasy Mini Kit試劑盒說明書進行抽提。相應cDNA樣品按照GoldScript cDNA 合成試劑盒說明書進行反轉錄獲得。大腸桿菌(E.coli)K88 DNA樣品按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書制備而成。獲取相應模板后,利用建立的三重PCR體系,檢測pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3的陽性質粒模板和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、輪狀病毒(RV)、豬庫布病毒(PKoV)、豬圓環病毒(PCV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(SFV)和大腸桿菌(E.coli)K88的cDNA/DNA樣品,以檢測所建立的三重PCR體系的特異性。

1.2.5敏感性試驗將1.2.2中稀釋后等量混合的pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3陽性質粒模板(質粒標準品)10倍梯度稀釋后,加入到本試驗建立的三重PCR體系,利用最佳引物體積和最適宜反應溫度進行擴增,以檢測三重PCR體系的敏感性。

1.2.6三重PCR的初步應用來自京津冀地區的臨床收集糞便樣品,以1∶5(m/V)的比例加入PBS稀釋,在渦旋儀上振蕩混合后,4 500 r/min,2 min離心后取上清液,分裝后存于-80 ℃備用。使用時按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書提取DNA作為模板進行三重PCR檢測。以部分檢出過PBoV的臨床樣品作為模板,使用建立的三重PCR方法和單項PCR方法分別檢測,以比較檢測結果的符合情況。

2結果與分析

2.1三重PCR反應條件優化結果

不同引物濃度的擴增結果如圖1所示,當PCR體系中PBoV1/PBoV2型引物量均為0.5 μL時,PBoV3型條帶擴增較好;且PBoV3型引物量為2 μL時,PBoV1/PBoV2/PBoV3型3個目的條帶均能得到很好的擴增,條帶大小分別為645,352,259 bp,與預期相符。

M.DL2000 DNA Marker;1～8.PBoV1/PBoV2/PBoV3引物量:

在最適宜溫度的優化試驗中,使用設計的3對引物在48～60 ℃內均能擴增出預期的目的條帶(圖2)。隨著溫度的不斷升高,PBoV1型目的條帶(645 bp)擴增較好,但PBoV2目的條帶(352 bp)和PBoV3型目的條帶(259 bp)的信號先增強然后變弱。從圖2中可以看出當溫度為57.8 ℃時,PBoV1/PBoV2/PBoV3型3個目的條帶均能得到很好的擴增,且條帶大小均與預期相符。

M.DL2000 DNA Marker;1～12.退火溫度:48.0,48.3,49.0,50.2,

通過對引物濃度和退火溫度的優化,最終確定三重PCR反應體系為:2×Es Taq Master Mix 12.5 μL,PBoV1F/PBoV1R(10 μmol/L)各0.5 μL,PBoV2F/PBoV2R(10 μmol/L)各0.5 μL,PBoV3F/PBoV3R(10 μmol/L)各2 μL,模板3 μL,加雙蒸水補足至25 μL;最佳反應條件為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸35 s,共35個循環；72 ℃延伸5 min。

2.2特異性試驗

用建立的三重PCR方法檢測pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3陽性混合質粒和單個質粒,均能得到預期的條帶;而對豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(RV)、豬庫布病毒(PKoV)、豬圓環病毒(PCV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(SFV)和大腸桿菌(E.coli)K88的cDNA/DNA樣品檢測則沒有條帶出現(圖3),說明該方法具有較好的特異性。

M.DL2000 DNA Marker;1.pEASY-BT1/pEASY-BT2/pEASY-BT3

2.3敏感性試驗結果

用雙蒸水將pEASY-BT1、pEASY-BT2和pEASY-BT3陽性混合質粒進行10倍梯度稀釋,使用建立的三重PCR體系進行擴增。從圖4中可以看出,利用該三重PCR擴增體系,陽性模板稀釋106后,仍能擴增出相應的目的條帶,其最低檢測限為8×10-7ng/μL。

M.DL2000 DNA Marker;1～8.100～107倍稀釋模板DNA。

2.4臨床樣品檢測結果

利用建立的三重PCR方法,對實驗室2015年2-8月間從京津冀地區豬場采集到的12份PBoV陽性糞便樣品進行檢測,同時與單項PCR檢測結果比較。結果顯示使用三重PCR體系的擴增結果與單項PCR擴增結果一致,符合率為100%(圖5)。

A.三重PCR檢測;B.PBoV1型檢測;C.PBoV2型檢測;D.PBoV3

3討論

PBoV自2009年發現以來,國內外許多國家均報道了它的流行。然而,PBoV基因型較多,研究認為,其可以分為PBoV1、PBoV2和PBoV 3型。其中,PBoV3型是最大的一個聚簇,其又分為PBoV3A、PBoV3B、PBoV3C、PBoV3D和PBoV3E 5個亞型,3型參考序列間同源性為76.0%～87.9%[10]。由于其基因型眾多,為臨床檢測帶來較大困難。本試驗根據這一特性,在序列分析的基礎上,設計了簡并引物。此外,在優化引物濃度時,由于PBoV3的引物中含有較多的簡并堿基,而PBoV1和PBoV2的引物中含有的簡并堿基較少或不含簡并堿基。因此PBoV1和PBoV2的引物選擇0.5，1 μL(10 μmol/L)2個濃度梯度,而PBoV3的引物選擇1.5,2 μL(10 μmol/L)2個濃度梯度相互組合,用來篩選最適宜的引物濃度。經過進一步優化建立了三重PCR檢測體系,其可以在同一反應體系中,同時檢測3種亞型PBoV病毒,使得PBoV的檢測更加簡捷。

多重PCR引物的設計,在普通PCR引物設計基礎上,仍需要注意以下3點:除每對引物不形成非特異性擴增外,不同引物對之間在同一體系中,也不形成非特異性擴增;每對引物形成的擴增片段大小要合適,能夠在PCR后的凝膠電泳中區分開各擴增片段;每對引物間的退火溫度差異要小,以適合使用同一擴增溫度進行擴增[18]。本試驗設計的3對引物,在進行三重PCR檢測時,未見非特異性擴增,其擴增片段大小分別為645,352,259 bp,能夠在凝膠電泳中區分目的片段,且在57.8 ℃退火條件下能夠擴增出清晰條帶,達到了試驗預期目的。

在利用本試驗建立的三重PCR檢測體系檢測京津冀地區豬腹瀉樣品時發現,所有基因型的PBoV均能在京津冀地區的豬腹瀉樣品中檢測到。同時,一份臨床樣品中,經常能檢測到不同亞型的PBoV感染,證明PBoV存在共感染的情況。Jiang等[19]的研究也揭示了共感染這一現象,PBoV的共感染在一定程度上,增加了不同PBoV基因型間發生重組的概率,易產生新的基因型,進而加速PBoV的序列進化。

本試驗根據PBoV的序列特性,建立了PBoV的三重PCR方法,在同一體系中可以同時檢測3種基因型的豬博卡病毒。試驗證實該方法具有較好的特異性和敏感性,并可用于臨床樣品的檢測。該方法的建立為豬博卡病毒3種不同基因型的高效檢測提供了有效手段。

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Development of a Triple PCR Method for Identifying Three Genotypes ofPorcinebocavirus

HONG Chunhui1,2,3,YANG Bing2,TAN Xiangjie2,ZHOU Hongzhuan2,XU Fuzhou2,SU Xia2,XUE Jing3,ZHANG Xiaodong3,WANG Jinluo2

(1.Animal Science and Technology College,Beijing University of Agriculture,Beijing102206,China;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Beijing Key Laboratory for Prevention and Control of Infectious Diseases in Livestock and Poultry,Beijing100097,China;3.Beijing Agro-biotechnology Research Center,Beijing100097,China)

Abstract：To develop a method for identifying three genotypes of Porcine bocavirus,3 pairs of primers against conserved regions were designed according to the published gene sequences of Porcine bocavirus,and the PCR products were 645 bp(PBoV1),352 bp(PBoV2),259 bp(PBoV3),respectively.By optimizing the reaction conditions,a triple PCR method for detecting all three genotypes of Porcine bocavirus was established for the first time.Results showed that no specific band was amplified from other porcine viruses by the triple PCR.The detection limit of the method was 8×10-7ng/μL.The results indicated that this method had not only good sensitivity but also high specificity.The clinical samples were used to detect three genotypes of Porcine bocavirus by the triple PCR and single PCR respectively with the coincidence of 100%.The establishment of the triple PCR method is helpful for identifying the three genotypes of Porcine bocavirus.

Key words:Porcine bocavirus;Genotype;Triple PCR;Detection

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.003

中圖分類號：Q78;S436

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0012-05

作者簡介：宏春慧(1988-),女,河北衡水人,在讀碩士,主要從事免疫與動物疫病防治研究。通訊作者：王金洛(1956-),男,四川自貢人,研究員,博士,主要從事畜禽疫病防治研究。

基金項目：北京市農林科學院科技創新能力建設專項(KJCX20140409);北京市科技計劃項目(Z131100003113015)

收稿日期：2016-02-13