SPF雞胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK細胞中的表達

陸玉建,吳信明,管　宇,張松林,李樹芳,韓文瑜,沈志強1,

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院 博士后科研工作站,山東 濱州　256600;2.吉林大學 博士后科研流動站,吉林 長春　130062;3.濱州學院 生命科學系,山東 濱州　256603;4.山東省濱州畜牧獸醫研究院,山東 濱州　256600;5.鄭州大學 生命科學院,河南 鄭州　450001)

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SPF雞胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK細胞中的表達

陸玉建1,2,3,吳信明4,管宇4,張松林4,李樹芳5,韓文瑜2,沈志強1,4

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院 博士后科研工作站,山東 濱州256600;2.吉林大學 博士后科研流動站,吉林 長春130062;3.濱州學院 生命科學系,山東 濱州256603;4.山東省濱州畜牧獸醫研究院,山東 濱州256600;5.鄭州大學 生命科學院,河南 鄭州450001)

摘要：為了提高MDCK細胞表面禽流感病毒(AIV)受體的水平,以12日齡的SPF雞胚為試材,通過反轉錄PCR擴增唾液酸轉移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并將回收的片段插入到pMD18-T載體中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo質粒,將目的片段進行連接,構建含有St3galⅠ基因的真核表達載體。利用脂質體介導法轉染MDCK細胞,在G418的篩選下,獲得具有抗性的轉基因細胞系。通過細胞克隆化培養和PCR檢測,篩選可穩定表達St3galⅠ基因的細胞株。結果表明,從雞胚中克隆的St3galⅠ基因成功的插入到pCI-neo質粒,從而實現真核表達載體pCI-neo-St3galⅠ的構建。在G418選擇壓力下,初步獲得了穩轉目的基因的MDCK細胞系。將抗性細胞混合克隆進行稀釋,經選擇后挑選出30個單克隆抗性細胞株。分別以轉染細胞基因組DNA和總RNA為模板,經PCR檢測顯示,目的基因已整合入MDCK細胞的基因組中并可穩定的進行表達。

關鍵詞：唾液酸;St3galⅠ基因;MDCK;轉染;G418;PCR

據統計,每年有3 000～5 000萬人感染流感病毒而引起嚴重的呼吸道疾病,在流感爆發的季節,則可造成數百萬人死亡[1]。流感病毒屬于正粘病毒科,具有分節的負鏈基因組,包括A、B、C3個屬,其中A型流感病毒可感染人、豬、馬等哺乳類和多種鳥類,在冬季較易發生[2]。禽流感(Avianinfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的一種禽類感染病,自1871年首次在意大利報道以來,世界各地多次出現AI的暴發和流行,不但給養禽業造成巨大的經濟損失,還對人類公共衛生安全構成嚴重的威脅[3-6]。禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)如何感染宿主，相關的分子機制還不清楚。目前,人們普遍認為AIV顆粒表面的血凝素(Hemagglutinin,HA)和宿主細胞表面受體起到了關鍵的作用[7]。HA是流感病毒最主要的糖蛋白,具有凝集紅細胞的能力和較強的免疫原性,能夠刺激機體產生保護性抗體,是流感疫苗研究的首選抗原,它可以識別靶細胞受體并與之結合,是AIV產生致病力和決定宿主特異性的重要蛋白[6,8]。病毒的增殖一般要經歷吸附、侵入、增殖、裂解和釋放等過程,AIV能夠吸附于宿主細胞,與細胞表面的唾液酸(Sialicacid,SA)具有密切的關系[3,9-10]。SA是指一系列含9個碳原子的羧基化單糖衍生物的總稱,在自然界分布廣泛,為構成糖類復合物結構和功能的重要單位[11-12]。SA常位于細胞表面糖蛋白、糖脂分子或其他多糖中糖鏈的最外側加帽位置,攜帶負電荷,對于細胞之間的識別及細胞和細胞外基質的相互作用有重要影響,可作為流感病毒的受體,流感病毒通過HA與宿主細胞SA特異性結合而感染宿主[13-15]。在唾液酸轉移酶(Sialyltransferases,STs)的作用下,SA可轉移到細胞表面的糖脂或糖蛋白末端[11,14-16]。SA常與糖鏈N末端的半乳糖(Galactoside,Gal)以α2,3或α2,6糖苷鍵連接[12,17-18]。流感病毒受體主要有2種:一種為唾液酸α-2,3半乳糖(SAα-2,3Gal);另一種為唾液酸α-2,6半乳糖(SAα-2,6Gal)[11,15]。大多數AIV優先結合于SAα-2,3Gal受體,人流感病毒則優先結合于SAα-2,6Gal受體[10,19]。生物體內的STs分為兩類:介導SA以α2,6糖苷鍵形式連接到Gal上的是ST6Gal轉移酶;介導SA以α2,3糖苷鍵形式連接到Gal上的是ST3Gal轉移酶,編碼該酶的基因有6種(St3galⅠ～Ⅵ),其中ST3GalⅠ和Ⅱ能使Ⅲ型糖鏈(Galβ1,3GalNAc-R)唾液酸化[18,20]。ST3GalⅠ催化完成AIV α2,3糖苷鍵連接結構的合成,負責把胞苷一磷酸-β-N-乙酰神經氨酸(CMP-Neu5AC)底物中的SA以α2,3連鍵的方式轉移到Galβ1-3(4)GlcNAc糖鏈上,從而形成AIV的完整受體[13,21]。傳統方法制備禽流感疫苗,通常采用雞胚培養法,該方法存在周期過長,成本較高等諸多不足之處,而以細胞作為基質培養AIV則不存在上述問題。但通過細胞生產AIV,現階段產率還較低。已有的研究表明,宿主細胞表面SA的含量與AIV的增殖具有密切的關系,STs在此過程中發揮重要作用。因此,通過基因工程技術提高細胞中STs的含量,對于細胞培養法生產AIV疫苗具有重要的意義。本試驗以12日齡的SPF雞胚為試材,利用RT-PCR擴增St3galⅠ基因,通過脂質體介導法轉染MDCK細胞,在G418選擇壓力下,經克隆化培養和分子檢測,成功獲得了可穩定表達St3galⅠ基因的細胞株。試驗結果對于增加宿主細胞表面唾液酸化水平,促進AIV在細胞基質中的有效增殖具有重要的現實意義。

1材料和方法

1.1試驗材料

SPF雞胚和MDCK細胞由山東綠都生物科技有限公司提供;pMD18-T載體、T4DNA連接酶和限制性內切核酸酶購自TaKaRa公司;pCI-neo載體和DH5α菌株由山東省濱州畜牧獸醫研究院保存;反轉錄試劑盒、TaqDNA聚合酶和DNA Marker3購自蘭州鵬程生物公司;質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、G418(新霉素)、DMEM培養基、胰蛋白酶、轉染試劑Lipofectamine 2000 Regeant購自Invitrogen公司;胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司;引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1引物的設計根據NCBI數據庫雞唾液酸轉移酶Ⅰ(ST3Gal Ⅰ)和β-actin基因序列信息,利用引物設計軟件Primer Premier 5設計引物(下劃線為添加的酶切位點)。St3galⅠ LP:5′-GGGGAATTC ATGGTCACCGTCAGGAAA-3′(EcoRⅠ),St3galⅠ RP:5′-GGGGTCGACTCATCTGCCCTTGAAAAAT-3′(SalⅠ);β-actinLP:5′-CCTCTATGCCAACACAGT-3′,β-actinRP:5′-GTACTCC TGCTTGCTGAT-3′。

1.2.2目的基因的克隆以12日齡的SPF雞胚為試材,提取RNA,反轉錄為cDNA,用高保真Taq酶擴增St3galⅠ基因。PCR反應體系如下:5×phusion10μL,10mmol/LdNTP4μL,St3gal Ⅰ LP 2 μL,St3galⅠ RP 2 μL,DMSO 1.5 μL,Template cDNA 2 μL,Nuclease-free water 28 μL,Phusion DNA polymerase 0.5 μL,總體積為50 μL。反應程序為:98 ℃預變性30 s;98 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環;72 ℃再延伸10 min;4 ℃保存。產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收目的片段并與pMD18-T載體進行連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。通過菌落PCR鑒定陽性克隆。反應程序如下:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環;72 ℃再延伸10 min。挑取陽性克隆,搖菌,提質粒,用EcoRⅠ-SalⅠ進行酶切鑒定。將含目的片段的質粒pMD18-T-St3galⅠ進行測序。1.2.3真核表達載體的構建分別用Sal Ⅰ-EcoRⅠ酶切pMD18-T-St3galⅠ(圖1-A)和pCI-neo質粒(圖1-B),將回收的目的片段連接,轉化,通過PCR和酶切篩選陽性重組克隆,從而實現真核表達載體pCI-neo-St3galⅠ的構建(圖1-C)。

圖1　pCI-neo-St3galⅠ載體構建策略

1.2.4G418敏感性試驗將MDCK 細胞接種 24 孔細胞培養板,待細胞匯合度達到80%左右時加入含G418的DMEM培養基,使其濃度分別為0,100,300,500,700,900 μg/mL,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養,每3～5 d更換一次篩選培養基。每日觀察細胞生長狀況,培養2周后繪制細胞生長曲線,確定G418的篩選濃度。

1.2.5MDCK細胞的轉染用無內毒素質粒提取試劑盒提取質粒,測定濃度。將MDCK細胞平鋪到24孔板,第2天細胞匯合度達到80%～90%時轉染。用無血清的DMEM稀釋質粒使其濃度達到2 μg/100 μL。在離心管中混合如下成分。溶液A:稀釋4 μg質粒DNA,溶于250 μL無血清DMEM中,混勻,在室溫下孵育約5 min。溶液B:取10～20 μL Lipofectamine 2000至250 μL無血清DMEM中,混勻,室溫下靜置約5 min。將溶液A與溶液B混合均勻,室溫孵育約20～25 min,使之形成DNA-脂質體復合物。將此復合物逐滴加到細胞表面,補加無血清DMEM培養基。培養4～6 h之后,除去培養物,更換含10% FBS的DMEM培養基。1.2.6細胞的克隆化培養稀釋轉基因細胞,調整細胞密度約為50個/100 μL。取2 μL細胞懸液加入96孔板,補加含G418的DMEM培養基100 μL。單細胞經10 d培養后可形成克隆群,將細胞消化后繼續培養,當匯合度達到90%時接入24孔板擴大培養。

1.2.7轉染細胞的分子檢測采用DNA提取試劑盒提取轉染細胞的基因組DNA,進行PCR鑒定;通過RNA提取試劑盒提取轉基因細胞總RNA,利用反轉錄試劑盒合成cDNA,以雞β-actin基因作為內參照,經RT-PCR檢測轉基因細胞中St3galⅠ的表達情況。

2結果與分析

2.1真核表達載體pCI-neo-St3galⅠ的構建

提取SPF雞胚總RNA,反轉錄為cDNA,用高保真PCR擴增St3galⅠ(圖2-A)。回收PCR擴增產物,連入pMD18-T載體,轉化大腸桿菌。菌落PCR鑒定結果顯示,擴增條帶和St3galⅠ基因大小一致(圖2-B)。挑取大腸桿菌陽性重組克隆,搖菌,提質粒。用EcoRⅠ-SalⅠ進行酶切,電泳后檢測發現,含目的基因的質粒可以切出2條合適大小的條帶(圖2-C),表明St3galⅠ基因已插入pMD18-T載體。用EcoRⅠ-SalⅠ酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo質粒,回收相應的目的片段,利用T4連接酶進行連接,然后將連接產物轉化大腸桿菌。通過對重組克隆進行PCR和酶切鑒定,表明St3galⅠ基因已插入pCI-neo質粒,從而實現真核表達載體pCI-neo-St3galⅠ的構建(圖2-D、E)。

A.RT-PCR擴增St3galⅠ基因的結果;B.菌落PCR篩選陽性克隆pMD18-T-St3galⅠ;C.EcoRⅠ-SalⅠ雙酶切鑒定

2.2MDCK穩轉細胞系的建立

2.2.1G418篩選濃度的確定G418(新霉素)是一種氨基糖苷類抗生素,通過抑制部分轉座子基因,干擾核糖體功能而阻斷蛋白質合成,當neo基因被整合進真核細胞DNA后,通過氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達,使細胞獲得抗性,從而能在含有G418的選擇性培養基中生長。由于不同細胞對G418的選擇壓不同,因此需要進行抗生素敏感性試驗。在24孔板中接種MDCK細胞,加入不同濃度的G418,觀察細胞的生長狀態并繪制細胞生長曲線,從而確定G418的篩選濃度。根據細胞生長曲線(圖3),G418 濃度達到500 μg/mL時,MDCK細胞于10～14 d全部死亡,高于此濃度,細胞在培養的早期大量死亡;低于此濃度,細胞在培養2周后仍有大量的細胞存活。因此選擇500 μg/mL為試驗中MDCK細胞壓力篩選培養基中G418的濃度。圖4為G418篩選14 d時細胞的生長狀態,可以發現,培養基中不添加G418時,細胞的生長基本正常,沒有明顯的細胞脫落(圖4-A);當G418的濃度達到100 μg/mL時,細胞已開始脫落,但貼壁細胞仍占優勢(圖4-B);當G418的濃度達到300 μg/mL時,細胞脫落已十分明顯,但仍有少量細胞貼壁生長(圖4-C);當G418的濃度達到500 μg/mL時,細胞幾乎全部脫落死亡,漂浮于培養基中(圖4-D);而當G418的濃度達到700～900 μg/mL時,培養基中幾乎觀察不到明顯的細胞(圖4-E、F)。

圖3　G418耐受細胞生長曲線

A～F.DMEM培養基中依次添加0,100,300,500,700,900 μg/mL G418第14 天時細胞的生長狀態。

2.2.2穩轉細胞系的建立純化pCI-neo和重組質粒pCI-neo-St3galⅠ,利用脂質體Lipofectamine2000轉染貼壁MDCK細胞,使用含500μg/mLG418的DMEM培養液進行篩選。在含G418的培養液中,未轉染質粒的細胞死亡,而轉染成功的細胞由于獲得G418抗性而存活。從圖5可以觀察到,在篩選培養基中生長12d的對照細胞全部死亡(圖5-A);而轉染pCI-neo和pCI-neo-St3galⅠ質粒的MDCK細胞成簇排列,生長旺盛(圖5-B、C)。試驗結果表明,通過G418篩選,初步獲得了穩轉目的基因的MDCK細胞系。

A.未轉染的MDCK細胞;B.轉染pCI-neo質粒的MDCK細胞;C.轉染pCI-neo-St3galⅠ質粒的MDCK細胞。

2.3單克隆抗性細胞株的篩選及分子檢測

將獲得的抗性細胞混合克隆進行稀釋,經選擇后挑選出30個單克隆抗性細胞株。連續篩選培養多代以后,單克隆細胞株生長狀態依然良好。顯微觀察發現,正常的MDCK細胞(野生型,WT)和空轉細胞的形態呈梭形(圖6-A、B);而部分轉染細胞近似棱形,排列更緊密,但形態差異并不太明顯(圖6-C)。提取轉染細胞基因組DNA,通過PCR檢測顯示,WT對照和轉入空載體的細胞均無擴增出合適的條帶,而轉入目的基因的細胞株則可擴增出1 kb左右的條帶,與St3galⅠ基因的大小一致(圖6-D);提取細胞的總RNA,RT-PCR鑒定后看出,穩轉細胞株均可擴增出合適大小的條帶,而對照組正常和空轉的MDCK細胞未見有擴增條帶(圖6-E)。上述分子檢測結果說明目的基因已成功整合入MDCK細胞的基因組中并可穩定的進行表達。

A.正常的MDCK細胞(WT);B.轉染pCI-neo質粒的MDCK細胞;C.轉染pCI-neo-St3galⅠ質粒的細胞;

3討論

以細胞作為基質培養流感病毒,具有均質性，保持流感病毒的抗原性不變及可操作性強等優點[22]。但目前這種方法生產流感病毒還存在產率低、流感病毒不適應宿主細胞或適應慢等缺點,這已成為制約細胞培養法生產流感病毒的瓶頸。因此,如何在細胞培養體系中有效地增殖流感病毒,已成為疫苗生產中亟待解決的關鍵問題。已有的研究表明,宿主細胞表面SA的含量與流感病毒的增殖具有密切的關系[13,19]。SA可以作為流感病毒的受體,與流感病毒HA蛋白結合,介導流感病毒侵入宿主細胞[1,7]。唾液酸轉移酶ST3GalⅠ能夠以胞苷一磷酸-β-N-乙酰神經氨酸(CMP-Neu5Ac)為底物將SA殘基轉移至新的糖基受體上形成唾液酸糖苷化合物[14]。本試驗從SPF雞胚中克隆出St3galⅠ基因,構建了pCI-neo-St3galⅠ真核表達載體。通過脂質體介導法轉染MDCK細胞,利用G418篩選轉基因細胞。由于不同種類的細胞或來源不同的同類細胞對G418的耐受性可能存在差異,因此,在篩選轉基因細胞之前,必須進行抗生素敏感性試驗[23]。根據試驗結果,最終確定轉染的MDCK細胞合適的G418篩選濃度為500μg/mL。在擬轉染的pCI-neo質粒上帶有抗性篩選標記,其表達的產物氨基糖苷磷酸轉移酶能夠抑制G418的活性,因此,轉染成功的細胞在含有G418的培養基中可以生長。此外,需要注意的是,細胞轉染后需經歷一段時間之后才會表達出蛋白質,一般要在轉染24h后方可加入G418進行篩選;G418添加過早,細胞難以存活,難以篩選到轉基因細胞;添加過晚,又會導致未轉染細胞大量增殖,從而抑制轉染細胞的生長。通過G418篩選獲得的具有抗性的轉基因MDCK細胞具有異質性,因此需要進行克隆化培養,進而篩選到性狀穩定的St3galⅠ基因高表達細胞株。由于1次克隆化培養獲得的細胞往往不純,所以需要將獲得的單克隆細胞再次進行克隆化。通過觀察獲得的細胞克隆,發現和正常的MDCK細胞形態差異并不明顯,由此可以推測,St3galⅠ基因在受體細胞基因組中整合的位點比較合適,幾乎沒有破壞細胞中原有基因的功能。本研究中,選取的表達載體中缺少熒光蛋白報告基因,雖然增加了對轉染細胞篩選的難度,但對于將來基因工程疫苗的開發卻極為有利,可以避免熒光蛋白對疫苗效果產生不良的影響。通過PCR檢測轉染細胞目的基因整合和轉錄情況,發現獲得的大部分克隆化細胞均可有效地表達St3galⅠ基因。并且,轉染細胞持續傳代后,St3galⅠ基因的表達情況并沒有發生明顯的變化。這些試驗結果說明,篩選的轉基因細胞性狀穩定,外源基因可以持續有效地表達。

目前,MDCK細胞被認為是培養甲型和乙型流感病毒最合適的細胞系,轉染成功的MDCK細胞內ST3GalⅠ的含量升高,可以增加宿主細胞表面的受體豐度,促進AIV與細胞的吸附,從而提高AIV在細胞基質中的產量。因此,在高質量、快速流感疫苗生產上有著廣闊的應用前景,特別是對于減少養禽業的經濟損失和降低人類感染AIV的風險具有更重要的意義。

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TheCloningofSt3galⅠGeneofSPFChickenEmbryoandItsExpressioninMDCKCells

LU Yujian1,2,3,WU Xinming4,GUAN Yu4,ZHANG Songlin4,LI Shufang5,HAN Wenyu2,SHEN Zhiqiang1,4

(1.Postdoctoral Programme,Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy,Binzhou256600,China;2.Postdoctoral Programme,Jilin University,Changchun130062,China;3.Department of Life Sciences,Binzhou University,Binzhou256603,China;4.Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy,Binzhou256600,China;5.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou450001,China)

Abstract：In order to improve the abundance of avian influenza virus(AIV)receptor on the surface of MDCK cells,12-day-old SPF chicken embryos was as material and St3galⅠgene was cloned by RT-PCR.Next,the target fragment was inserted to the pMD18-T vector.Subsequently,the pMD18-T-St3galⅠ and pCI-neo plasmids were digested and connected.Thus,the eukaryotic expression vector containing St3galⅠgene was constructed.Afterwards,the pCI-neo-St3galⅠ plasmid was purified and transfected into MDCK cell by liposome-mediated method.The transgenic cell lines were screened by G418.The cell strains expressing St3gal Ⅰ gene stably were initially obtained by cell cloning culture and PCR assay.The results showed that St3galⅠgene from chicken embryo was successfully inserted into pCI-neo plasmid,leading to the construction of the eukaryotic expression vector pCI-neo-St3galⅠ.In the G418 selection pressure,MDCK cells stably transfected target gene were initially obtained.The resistant cells were diluted,and 30 selected monoclonal resistant cell lines were selected.With genomic DNA and total RNA of transfected cells as a template,PCR analysis showed that the target gene had been integrated into the genome of MDCK cells and stably expressed.

Key words:Sialic acid;St3galⅠgene;MDCK;Transfection;G418;PCR

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.009

中圖分類號：Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0045-07

作者簡介：陸玉建(1979-),男,河南南陽人,講師,博士,主要從事細胞工程及分子生物學研究。通訊作者：沈志強(1963-),男,山東榮成人,研究員,博士，主要從事預防獸醫學研究。

基金項目：山東省自然科學基金項目(ZR2012CL14);山東省濱州畜牧獸醫研究院博士后科研基金項目(BSH2014001)

收稿日期：2016-02-03