重組減蛋綜合征病毒KnobS干酪乳桿菌的構建與表達

郭建軍,袁　林,曾　靜,邱小忠,付錦楠

(江西省科學院 微生物研究所,江西 南昌　330096)

?

重組減蛋綜合征病毒KnobS干酪乳桿菌的構建與表達

郭建軍,袁林,曾靜,邱小忠,付錦楠

(江西省科學院 微生物研究所,江西 南昌330096)

摘要：以干酪乳桿菌為傳遞載體,以開發食品級安全的減蛋綜合征病毒疫苗為目標,構建了一個溫度敏感型自殺型質粒系統pORZP-UKD。將該質粒電轉化到干酪乳桿菌L.casei中,經過2次升溫處理和5-氟尿嘧啶抗性篩選,挑選陽性克隆,采用 PCR和 SDS-PAGE方法進行鑒定。KnobS基因整合到干酪乳酸桿菌基因組內,并實現融合蛋白KnobS的分泌表達。表明得到了一株具有無任何選擇性標記、攜帶有KnobS表達盒元件的基因組整合的重組干酪乳酸桿菌KnobSΔupp L.casei,且整合的外源基因能夠隨著細菌的復制而進行表達,為減蛋綜合征病毒免疫保護性抗原KnobS疫苗的進一步研制提供了試驗數據。

關鍵詞：干酪乳桿菌;減蛋綜合征病毒KnobS蛋白;基因組表達

減蛋綜合征病毒(Eggdropsyndromevirus,EDSV)是禽腺病毒Ⅲ群中唯一的成員[1]。其宿主范圍較廣,毒株毒力差異較大,主要引起以群發性產蛋下降、產蛋異常、蛋體畸形、蛋質低劣等為特征的傳染病[2]。纖維蛋白是腺病毒的主要結構蛋白,可以識別細胞膜上的特異性受體[3],也可以阻斷大分子的合成,抑制病毒的增殖[4],且帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇,即減蛋綜合征病毒主要免疫保護性抗原纖維蛋白 KnobS就是 EDSV 的主要保護性抗原成分[5]。病毒通過腸道黏膜吸收或感染引起動物發病,以增強黏膜免疫為主的免疫方式是預防該病的有效措施[1-3]。

乳酸菌作為人和動物腸道、呼吸道和泌尿生殖道中的常在益生菌群之一[6],在食品發酵、飲品和飼料等領域有著悠久的應用歷史,早被公認為安全級微生物,它能維持動物腸道菌群平衡,促進動物對營養物質的吸收,提高動物機體的免疫力,特別是在提高人和動物的胃腸道黏膜免疫功能方面[7-9]。乳酸菌作為宿主菌表達外源蛋白或抗原的研究取得了一定進展,并已證明重組乳酸菌可有效提高黏膜免疫系統提呈抗原及誘導特異性免疫應答的能力,具有成為新型口服疫苗誘導黏膜免疫應答的潛力[6,10],這為進一步將乳酸菌開發安全級的新型活載體疫苗誘導黏膜免疫奠定了重要的理論和實踐基礎[11]。目前對于乳酸菌作為抗原傳遞系統表達外源抗原的研究主要集中在質粒表達的研究方面[10,12]。質粒表達系統存在篩選的抗生素抗性基因,以此作為疫苗可能會使動物產生抗生素耐藥性問題[6,13],不符合生物安全標準。而且,質粒表達系統存在不穩定性,質粒容易丟失等缺陷。

本研究以干酪乳桿菌為傳遞載體,以開發食品級安全的減蛋綜合征病毒疫苗為目標,成功構建得到了一株具有無任何選擇性標記、攜帶有KnobS表達盒元件的基因組整合的重組干酪乳酸桿菌,且整合的外源基因能夠隨著細菌的復制而進行表達,為進一步研究 EDSV纖維蛋白KnobS生物學功能奠定了基礎,并對開發預防EDSV的基因工程疫苗的研究具有一定參考作用。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株、質粒、培養基和生長條件大腸桿菌DH5α、干酪乳桿菌Lactobacilluscasei393-Δupp[13]、質粒 pMG36e-UP/LTB-KnobS和經改造質粒 pORZP[14]由江西省科學院微生物研究所生物工程中心保存和提供;克隆用質粒 pMD18T-simple 購自大連寶生物公司。

干酪乳桿菌常規培養在 MRS培養基,30 ℃靜止培養;大腸桿菌常規培養用 LB 培養基,37 ℃振蕩培養。干酪乳桿菌感受態制備用培養基以及方法參照文獻[8]。

1.1.2主要試劑和材料限制性內切酶、高保真DNA聚合酶、T4DNA連接酶、蛋白質Marker、DL2000 Marker、克隆載體pMD18T-simple均購自大連TaKaRa公司;MRS培養基購自Oxoid公司;基因組DNA提取試劑盒、質粒抽提試劑盒、DNA純化試劑盒購自愛思進公司;電擊杯為BioRad產品;引物委托上海生工公司合成,其余試劑均為國產分析純。

1.1.3引物設計根據質粒 pMG36e-UP/LTB-KnobS上KnobS基因表達盒的基因序列[4]和 GenBank 中已登陸的干酪乳桿菌slpA基因的全序列[12],設計3對引物分別用于擴增質粒 pMG36e-UP/LTB-KnobS上KnobS基因表達盒片段、含干酪乳桿菌slpA基因的同源重組左右臂slpA-up和slpA-down,在各上下游引物的5′端加入保護堿基和酶切位點(劃線部分),各限制性內切酶位點為構建元件定向克隆到構建骨架質粒載體 pORZP而設計。各引物序列見表1。

表1　引物序列及酶切位點

1.2試驗方法

1.2.1擴增KnobS基因表達盒KnobS-cassette從質粒pMG36e-UP/LTB-KnobS擴增含啟動子P32、分泌信號肽基因序列(ssusp)、具有黏膜免疫佐劑的大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)及編碼減蛋綜合征病毒主要免疫保護性抗原纖維蛋白KnobS基因序列的基因表達盒基因片段,并設計引物K1/K2,以含有KnobS基因表達盒全序列的 pMG36e-UP/LTB-KnobS為模板進行 PCR 擴增,PCR 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。目的片段KnobS-cassette與克隆載體pMD18T-simple連接,轉化后,涂布于含有氨芐抗性的 LB培養基,挑選陽性結果,提取質粒用SalⅠ/XmaⅠ酶切初步鑒定,進行測序,所獲得質粒命名為pMD18-KnobS。

1.2.2同源重組臂的擴增根據 GenBank(Accession:M60178.1)公布的LactobacilluscaseiATCC 334基因序列和GenBank(Accession:X76884)公布的slpA基因序列設計引物P1/P2和D1/D2,并分別以Lactobacilluscasei393基因組為模板擴增同源重組左右臂slpA-up和slpA-down,引物設計見表1。然后連接到TaKaRa的pMD-18T simple 載體。轉入DH5α,藍白斑篩選,提取質粒PCR擴增鑒定和測序驗證,獲得質粒分別命名為pMD18-slpA-up和pMD18-slpA-down。

1.2.3同源整合載體 pORZP-UKD 的構建質粒 pORZP 和質粒 pMD18-KnobS分別用限制性內切酶SalⅠ和XmaⅠ進行雙酶切,回收酶切過的目的片段,用 T4DNA連接酶將兩基因片段連接得到質粒pORZP-K。將質粒pORZP-K和質粒pMD18-slpA-up分別用限制性內切酶PstⅠ和SalⅠ進行雙酶切,純化目的片段,將同源左臂slpA-up基因片段連接到pORZP-K 雙酶切得到的較大片段上,獲得重組質粒 pORZP-UK。質粒pORZP-UK和質粒pMD18-slpA-down分別用限制性內切酶SacⅠ和XmaⅠ進行雙酶切,回收兩目的酶切片段。將同源右臂基因片段slpA-down連接到 pORZP-UK雙酶切得到的較大片段上,得到最終目的同源整合載體pORZP-UKD。

將以上構建得到的質粒載體轉化大腸桿菌DH5α,提取質粒 pORZP-UKD,采用酶切和 PCR 方法鑒定陽性克隆并保存備用。

1.2.4同源整合載體轉化干酪乳桿菌將同源整合載體質粒pORZP-UKD電轉化入攜帶有輔助質粒pTRK669的干酪乳桿菌Lactobacilluscasei393-Δupp的感受態細胞中,轉化后的干酪乳桿菌涂布于同時含有氯霉素(5 mg/L)和紅霉素(5 mg/L)的MRS培養基平板上;挑選出長勢較好的菌落,在高溫(42 ℃)和含抗性(5 mg/L紅霉素) 雙重選擇壓力下連續傳代培養3次,使之進行同源重組;然后通過重組菌在含100 μg/L 5-氟尿嘧啶(5-FU)的MRS培養基上,37 ℃培養,反復傳代多次,以篩選整合突變體。

1.2.5重組干酪乳桿菌的篩選與鑒定經篩選得到的整合突變體提取基因組DNA,通過 PCR 驗證確定基因KnobS是否已經整合到干酪乳桿菌的染色體上。通過 PCR 擴增質粒載體上存在的基因KnobS,以驗證載體是否已整合。將選擇得到的整合轉化子接種至含5-氟尿嘧啶的MRS液體試管中,37 ℃振蕩培養過夜,提取其基因組 DNA,用引物K1/K2進行PCR檢測,并回收目的片段送上海生工測序。同時將培養后的菌液先離心去除菌體后,取 30%和 80%(NH4)2SO4之間的沉淀物用少量去離子水溶解,進行 SDS-PAGE 電泳。

2結果與分析

2.1KnobS基因表達盒KnobS-cassette的擴增

以pMG36e-UP/LTB-KnobS質粒DNA 為模板進行PCR 擴增,擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,可清晰見到約970 bp的特異性擴增帶,與預期結果相符(圖1-A)。用凝膠DNA回收試劑盒回收產物經純化后克隆至 pMD18T-simple,用SalⅠ/XmaⅠ消化后可產生一條約1 000 bp的片段(圖1-B),與預計相同。測序結果表明PCR 產物與KnobS-cassette基因序列完全一致。

A：1.PCR擴增KnobS-cassette;M.DL2000 DNA Marker。

2.2同源整合載體的構建

以Lactobacilluscasei393基因組DNA 為模板進行PCR 擴增,用 P1/P2 PCR 擴增得到615 bp的slpA-up;引物 D1/D2 PCR擴增得到567 bp的slpA-down;PCR 結果見圖2,由圖可知,成功獲得同源重組臂slpA-up和slpA-down,分別連接到pMD18T-simple載體,用相應的酶進行鑒定,可切出約610 bp 的slpA-up和560 bp 的slpA-down,測序正確,分別命名為 pMD18-slpA-up和pMD18-slpA-down,表明構建成功。

1.同源重組左臂slpA-up;2.同源重組右

依次將克隆得到的KnobS基因表達盒KnobS-cassette(969 bp )、同源重組左臂slpA-up基因(615 bp)和同源重組右臂slpA-down片段(567 bp )構建至質粒pORZP上。 成功構建得到整合表達載體pORZP-UKD,其片段大小為 5 246 bp,整個構建過程見圖3。

圖3　同源整合載體pORZP-UKD的構建

2.3同源重組及鑒定

同源整合載體pORZP-UKD電轉化Lactobacilluscasei393-Δupp感受態細胞,涂布于含紅霉素和氯霉素抗性的平板,挑取單菌在含紅霉素的MRS平板,42 ℃培養,傳代培養3次,使之進行同源重組;然后通過在含5-氟尿嘧啶的MRS培養基上,37 ℃培養,反復傳代多次,篩選整合轉化子,選取在含100 μg/L 5-氟尿嘧啶的平板上長勢較好的單菌落作為突變體,以此作為重組菌株,KnobS基因的整合過程見圖4。

圖4　同源整合模式

將篩選得到突變體提取基因組DNA,通過PCR擴增同源整合載體上存在的KnobS基因表達盒KnobS-cassette序列,以確定KnobS基因是否已經整合到干酪乳桿菌的染色體上,并以初始菌株Lactobacilluscasei393-Δupp作為陰性對照。 結果見圖 5。凝膠電泳檢測發現篩選到的 5 個突變體的基因組均擴增出KnobS基因特異性條帶,且大小與預計相符,而出發菌株Lactobacilluscasei393-Δupp無此條帶,這證明構建的重組質粒載體pORZP-UKD中的KnobS基因已整合到干酪乳桿菌基因組中。

M.DNA Marker DL2000;1.初始菌株;2～6.重組菌株轉化子。

2.4同源整合載體的功能驗證

收集重組菌培養的菌液,進行SDS-PAGE電泳分析,凝膠經考馬斯亮藍G250染色和甲醇/冰乙酸脫色后,放入凝膠成像系統中分析目的蛋白,結果表明(圖6-A),重組蛋白 KnobS以分泌型表達的形式表達,符合預期大小約 33 kDa。利用KnobS抗體對目的蛋白進行免疫印跡分析可見目的條帶且無雜帶,表達產物重組蛋白KnobS能被陽性血清所識別,也驗證了表達產物為蛋白KnobS(圖6-B),說明實現KnobS基因同源整合到干酪乳桿菌中,并能夠分泌表達具有免疫學活性的重組融合蛋白KnobS。

A:1.蛋白分子量標準;2～3.Δupp L. casei細胞及培養液上清;

3討論

由于乳酸菌是人和動物腸道常在的益生菌[6],所以它的安全是毋庸置疑的,目前已經有些病原體抗原保護性抗原在乳酸菌中進行表達[10,12],通過免疫分析該表達系統不僅能夠刺激機體產生細胞免疫還能刺激機體產生體液免疫[8,15],這對于抵抗病原微生物的感染是非常重要的[7]。但是上述表達形式均是以質粒形式進行的,雖然質粒的多拷貝性使得外源基因能夠得到高效表達,并產生較強的免疫效果[13],但是,質粒的不穩定性會導致外源基因尤其是抗生素抗性基因的遷移[16],將外源基因構建于質粒載體而獲得基因工程菌在疫苗領域中應用受到極大限制,因此,構建生態安全型的基因工程菌株就是將外源基因整合到受體菌基因組上且不帶入外源抗性基因。為了構建一株無任何選擇性標記的食品級疫苗候選株,筆者選擇了溫度敏感型載體,當溫度升高到42 ℃以上時,該質粒不發生復制,同時還可以通過載體上設計的同源臂序列和宿主染色體DNA發生位點特異性重組,從而獲得一株無任何選擇性抗性的基因組整合重組菌株。

pORI系統利用了溫度敏感型雙質粒的復制互補功能,該系統由輔助質粒和主質粒組成,其中輔助質粒攜帶完整野生型pORI復制子,基因打靶的主質粒即雙交換重組的轉移載體,攜帶缺失repA基因的pORI溫度敏感型穿梭型缺陷型復制子系統,主質粒只需要轉化一次,通過2次同源重組后可獲得無痕操作的突變體[13,16],篩選簡易方便,不產生假陽性突變體。Douglas等[12]利用pORI系統將gusA3報告基因分別插入到嗜酸乳桿菌NCFM中3個高表達區域和一個低表達區域,每個位點的gusA3表達用ELISA方法測定gusA3的活性。Goh等[17]應用已經構建的pORI-based敲除系統,通過雙重組將slpX基因的S層蛋白敲除。Kristich等[18]在糞腸球菌研究中利用5-FU作為陽性/陰性選擇性標,構建了srtA突變體。在L.caseATCC 393中,upp基因也是非必需基因[19],如果將該基因缺失該菌株就能獲得5-FU抗性,因此,可以將upp基因作為反選擇標記基因[20]。

在本研究中,利用upp基因可缺失的特性構建了反選擇標記替換系統[20],并構建KnobS表達盒代替upp基因。重組菌通過2次升溫之后,涂含5-FU抗性的MRS抗性平板進行篩選。篩選出的單菌落用PCR的方法進行初步鑒定,用Western Blot的方法驗證得到目的條帶,可以斷定其所構建的基因組整合菌株確實能夠有效地表達外源蛋白,得到了安全無毒的重組產減蛋綜合征病毒主要免疫保護性抗原纖維蛋白KnobS口服活菌疫苗,為減蛋綜合征病毒免疫保護性抗原KnobS疫苗的研制奠定了基礎。本研究也為構建攜帶其他病原體抗原的基因組整合重組干酪乳桿菌的研制提供了可靠的技術保障和理論基礎。

參考文獻：

[1]Fingerut E,Gutter B,GalliliG,et al.A subunit vaccine against the adenovirus egg-drop syndrome using part of its fiber protein[J].Vaccine,2003,21(21):2761-2766.

[2]Gutter B,Fingerut E,Gallili G,et al.Recombinant egg drop syndrome subunit vaccine offers an alternative to virus propagation in duck eggs[J].Avian Pathology,2008,37(1):33-37.

[3]Tomko R P,Johansson C B,Totrov M ,et al.Expression of the adenovirus receptor and its interaction with the fiber knob[J].Experimental Cell Research,2000,255(1):47-55.

[4]郭建軍,范漢東,楊一兵.減蛋綜合征病毒纖維蛋白主要抗原結構域原核表達及抗原性鑒定[J].畜牧與獸醫,2012,44(2):22-25

[5]鄭金,陳滔,陸吉虎,等.減蛋下降綜合征病毒重組KnobS基因在桿狀病毒系統中的表達及其免疫原性鑒定[J].江蘇農業學報,2015,31(3):600-603.

[6]史達,宋巖,李一經.乳酸乳球菌作為黏膜免疫活載體疫苗傳遞抗原的研究進展[J].微生物學報,2006,46(4):680-683.

[7]李超,王春鳳,楊桂連.乳酸菌胞外多糖腸道黏附及免疫調節作用研究進展[J].食品科學,2014,35(11):314-318.

[8]董懿櫻,陳臣,任婧,等.乳酸菌對腸免疫調節功能研究進展[J].中國微生態學雜志,2014,26(2):221-224.

[9]Mohammed B E D,Gahan C G M,Griffin B T.Lactococcuslactisas a cell factory for delivery of therapeutic proteins.[J].Current Gene Therapy,2010,10(1):34-45.

[10]王相清.共表達豬細小病毒VP2與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位重組乳酸桿菌構建及其免疫學初步評價[D].哈爾濱：東北農業大學,2009.

[11]Wells J M,Mercenier A.Mucosal delivery of therapeutic and prophylactic molecules using lactic acid bacteria [J].Nat Rev Microbiol,2008,6(5): 349-362.

[12]Douglas G L,Klaenhammer T R.Directed chromosomal integration and expression of the reporter genegusA3 inLactobacillusacidophilusNCFM[J].Appl Environ Microbiol,2011,77(20)：7365-7371.

[13]郭建軍,袁林,曾靜,等.干酪乳桿菌Lactobacilluscasei393upp基因突變株的構建[J].江西科學,2015,33(03):308-311.

[14]郭建軍,龔小華,袁林,等.干酪乳桿菌同源整合載體的構建與鑒定[J].江西科學,2015,33(04):491-494,518.

[15]García-Fruitós E.Lactic acid bacteria: a promising alternative for recombinant protein production[J].Microbial Cell Factories,2012,11(1):1-3.

[16]宋佰芬.產氣莢膜梭菌α毒素基因在干酪乳桿菌基因組中的表達及免疫效果評價[D].哈爾濱:東北農業大學,2014

[17]Goh Y J,Azcarate-Peril M A,O'Flaherty S,et al.Development and application of a upp-based counterselective gene replacement system for the study of the S-layer protein SlpX ofLactobacillusacidophilusNCFM [J].Appl Environ Microbiol,2009,75(10): 3093-3105.

[18]Kristich C J,Manias DA,Durmy GM.Development of a method for markerless genetic exchange inEnterococcusfaecalisand its use in construction of a srtA mutant[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(10)：5837-5849.

[19]楊奇.大腸桿菌DH5αupp基因的敲除及其應用研究[D].南京：南京理工大學,2013.

[20]宋麗.乳酸乳球菌upp基因缺陷互補型質粒載體系統的構建及其缺失菌生物學特性研究[D].哈爾濱：東北農業大學,2015.

The Construct and Expression ofKnobSGene ofEggdropsyndromevirusinL.caseiGenome

GUO Jianjun,YUAN Lin,ZENG Jing,QIU Xiaozhong,FU Jinnan

(Institute of Microbiology,Jiangxi Academy of Sciences,Nanchang330096,China)

Abstract：To develop an EDSV(Egg drop syndrome virus) vaccine that live up to the standard of food safety,a temperature-sensitive suicide plasmid pORZP-UKD was constructed using L.casei as a transmitted vector.After transforming it into L.casei using electric shock,two temperature-elevating treatments and a 5-FU screening were performed to get positive clone.Upon the identification of putative clone by PCR and SDS-PAGE,we successfully obtained a recombinant strain,KnobSΔupp L.casei,which has no selective-marker but harbors a KnobS expression box.Any exogenous gene can be integrated into this recombinant strain and express its products as bacteria replicate itself,thus providing the experimental basis for the further development of protective Knobs antigen vaccine against Egg drop syndrome virus.

Key words:Lactobacillus casei;KnobS protein of Egg drop syndrome virus;Genome expression

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.014

中圖分類號：Q78;S432.4+1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0081-06

通訊作者：袁林(1980-),男,江西德安人,助理研究員,博士,主要從事基因工程與分子生物學研究。

作者簡介：郭建軍(1984-),男,江西崇仁人,助理研究員,碩士,主要從事有益微生物分子遺傳及資源利用研究。

基金項目：江西省科技支撐計劃項目(20142BBF60036);江西省自然(青年)科學基金項目(2013BAB214014)

收稿日期：2016-02-15