去勢對淮南豬皮下脂肪PPAR信號通路基因表達量的影響

王　璟,白獻曉,張家慶,高彬文,陳俊峰,高　原,任巧玲,馬　強,郭紅霞,梁永紅,邢寶松

(1.河南省農業科學院 畜牧獸醫研究所,河南 鄭州　450002;2.新縣畜牧局,河南 新縣　465550)

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去勢對淮南豬皮下脂肪PPAR信號通路基因表達量的影響

王璟1,白獻曉1,張家慶1,高彬文1,陳俊峰1,高原2,任巧玲1,馬強1,郭紅霞1,梁永紅1,邢寶松1

(1.河南省農業科學院 畜牧獸醫研究所,河南 鄭州450002;2.新縣畜牧局,河南 新縣465550)

摘要：為了研究PPAR信號通路在豬去勢誘導的脂肪沉積中的作用，采集去勢和非去勢淮南豬(共6頭,每組各3頭)的皮下脂肪組織,提取總RNA后構建文庫,利用高通量測序技術檢測PPAR通路相關基因表達量,表達差異基因的篩選閾值為P<0.05且|log2差異倍數|>1。基于mRNA的差異分析以及KEGG富集分析發現,PPAR信號通路中17個基因表達差異達到顯著水平,其中14個基因表達量上調、3個基因表達量下調。腦型脂肪酸結合蛋白基因(FABP7)、甘油水孔蛋白基因(AQP7)、視黃素X受體γ基因(RXRγ)等基因上調,而磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1基因(PCK1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α基因(PPARGC1α)、膽固醇7α-羥化酶1基因(CYP7A1)參與分解代謝的基因顯著下調。

關鍵詞：淮南豬;差異表達基因;高通量測序;PPAR信號通路;脂肪沉積

中國擁有80多個地方豬品種,列入中國豬種品種志的有48個,是世界上豬種質資源最豐富的國家之一。國外豬種的肉質存在肌內脂肪含量低、肉色灰白、系水力低等缺點,河南地方豬種如淮南豬、確山黑豬等具有肉色鮮紅、系水力強、肌內脂肪含量高、肌纖維細等優點,對高檔豬肉生產具有重要意義[1]。淮南豬1986年被列入河南省地方優良畜禽品種志,主要產區集中在淮河上游以南,歸屬于黃淮海黑豬、華北型。該豬種耐熱、耐粗飼、產仔數多、生長發育較慢,仔豬出生質量約為0.8 kg,成年公豬體質量平均為149.7 kg,成年母豬為104.9 kg[2]。淮南豬達90 kg的時間大約需要240 d(顯著長于國外引進品種),此階段淮南豬的背膘厚約為3.35 cm,胴體含脂率約為33.5%,均顯著高于國外引進品種[3]。因此,淮南豬可以作為研究中國地方豬肉質性狀的代表品種。

研究表明,過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路參與調控脂質代謝、能量代謝、炎癥反應、胚胎著床等。PPARs屬于核激素受體超家族,核激素受體是一類轉錄因子,能夠結合在DNA并以配體依賴方式調控其轉錄[4]。PPARs通過結合類視黃醇X受體(RXR)形成異二聚體,結合在靶基因的過氧化物酶體增殖反應元件(PPRE反應元件)上,進而調控其轉錄水平[5]。PPAR基因家族包含PPARα、PPARβ/δ和PPARγ3個成員,在多種生物過程中起調控作用,例如能夠增強機體胰島素的敏感性、調節體內糖平衡,尤其是通過調控各種參與細胞脂類代謝基因的表達進而影響脂肪細胞的分化[6]。PPARα基因促進甘油三酯分解為游離脂肪酸,同時刺激肌肉和肝臟β氧化進而降低脂肪酸和甘油三酯的合成[7]。PPARβ能夠上調前脂肪細胞中多種成脂相關基因的表達,與細胞的基礎脂肪代謝相關,加快能量代謝促進脂肪氧化。PPARγ基因是調控前體脂肪細胞分化的關鍵轉錄因子,通過轉錄水平影響脂肪酸及其衍生物的功能進而調節細胞的增殖分化,其在脂類代謝過程中也起到重要作用[8]。PPAR信號通路其他成員在脂質代謝過程中也起到非常重要的作用,例如過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α基因(PPARGC1α)、視黃素X受體γ基因(RXRγ)、脂滴包被蛋白(PLIN1)等。

去勢能夠促進機體脂肪沉積,在動物生產中廣泛應用。仔公豬去勢后失去雄性激素分泌的基礎,機體出現缺乏雄性激素導致的“肥胖”[9]。開展去勢公豬的相關研究有助于闡釋動物脂肪沉積的分子機制。目前關于去勢增加脂肪沉積有一些研究,但其分子調控機制尚不清楚,因此本研究使用高通量測序技術,對淮南豬皮下脂肪進行測序和生物信息學分析,以期找到PPAR信號通路基因在去勢豬和非去勢豬皮下脂肪中的表達差異,有助于進一步理解去勢促進豬脂肪沉積的分子調控機制。

1材料和方法

1.1供試動物

選取3對淮南豬仔豬,每對仔豬同窩且出生體重相似。3對仔豬每對中隨機選擇1頭在5周齡時進行手術閹割,另1頭在腹部劃相同大小切口作為偽處理,從而產生相同的應激反應。所有豬按照商品豬的飼養流程進行飼養。

1.2組織樣品

于210日齡時對6頭試驗豬進行屠宰,屠宰后30 min內采集皮下脂肪樣品,樣品剪成黃豆大小,放在凍存管中立即投入液氮中,運輸至實驗室后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3總RNA提取及質量檢測

使用柱式動物組織總RNA抽提純化試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取6頭豬皮下脂肪的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的質量,使用紫外分光光度計(IMPLEN,NanoPhotometer)分析所提RNA的濃度。RNA用干冰包裝后,送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司測序。

1.4上機文庫制備及質檢

檢測合格的總RNA構建文庫:使用Epicentre Ribo-ZeroTM試劑盒去除核糖體RNA;加入Fragmentation Buffer把mRNA片段化,形成150～200 bp的短片段;以短片段為模板,使用六堿基的隨機引物進行第一鏈cDNA合成,然后加入緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶Ⅰ進行第二鏈cDNA的合成;利用AMPure XP beads純化后的雙鏈cDNA進行末端修復、3′-腺苷酸化為cDNA末端加A、連接Illumina接頭,然后使用AMPure XP beads進行片段大小選擇。之后用USER酶降解含有U的cDNA第二鏈,最后進行PCR富集得到鏈特異性cDNA文庫。

文庫構建完成后,先使用Qubit2.0進行初步定量,稀釋文庫至1 ng/μL,隨后使用Agilent 2100檢測文庫的插入片段大小(Insert size),符合預期后使用qPCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2 nmol/L),以保證文庫質量。

1.5高通量測序和生物信息學分析

檢測合格的文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求進行HiSeq測序。所得原始測序序列,將帶接頭的、低質量的序列進行過濾,從而得到Clean reads。使用Tophat2對過濾后的序列與豬的參考基因組(Scrofa10.2)進行比對分析,得到Mapped Data。基因表達水平用FPKM值表示,是每百萬片段中來自某一個基因每千堿基長度的片段數目。通過Mapped Data分析基因的表達差異,篩選閾值為P值<0.05且|log2差異倍數|>1。PPAR信號通路主要成員信息見表1。

表1　PPAR信號通路部分成員介紹

2結果與分析

2.1差異表達基因分析

圖1所示為去勢與非去勢豬的皮下脂肪組織差異表達mRNA KEGG富集表達聚類,其中代謝通路相關基因表達量較高用深顏色表示,表達量較低用淺顏色表示。所列出的20個通路中,有與機體糖脂代謝調控相關的如Ⅱ型糖尿病通路(14個差異基因)、胰島素信號通路(28個差異基因)、AMPK信號通路(29個差異基因)、甘油酯代謝通路(16個差異基因)等。已知PPAR信號通路相關基因調控機體能量代謝,尤其與胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病、肥胖等糖脂代謝紊亂疾病相關[6]。本研究中PPAR信號通路在去勢組顏色較深而非去勢組顏色較淺,說明其表達量在去勢組較高而非去勢組較低。與其他通路相關基因表達量相比,去勢組PPAR信號通路相關基因表達量非常高,提示該通路在去勢豬脂肪沉積過程中起重要作用,值得進一步深入研究。

圖1　差異表達mRNA KEGG富集表達聚類

2.2PPAR通路相關基因差異表達情況

由表2可知,與非去勢組相比,去勢組PPAR信號通路共有17個基因表達量變化達到篩選閾值。其中上調基因14個,下調基因3個。去勢組FPKM值變化為0.069～547.697,而非去勢組為0.292～152.724。差異表達基因log2差異倍數的范圍從-4.568到4.123，平均值為2.012。

表2　去勢組與非去勢組PPAR通路相關基因表達量

3討論與結論

FABP7基因上調倍數最高,其|log2差異倍數|為4.123,該基因最早是從腦組織中分離出來的,在肝臟中表達量也較高,其主要作用是調節脂肪酸的攝取和細胞內運輸。吳丹[26]通過全基因組關聯分析發現FABP7基因與北京油雞體重及屠體性狀相關。方心靈等[27]研究發現,FABP7基因在嶺南黃羽肉公雞禁食48 h顯著下調。何侃等[28]研究發現,FABP7基因與SREBP-1C顯著相關,而后者作為重要的核轉錄因子,在膽固醇和脂肪酸的合成代謝中發揮了重要作用,對動物脂肪代謝過程具有重要的調控作用。這些均提示該基因能夠促進機體合成代謝,而在本研究中,FABP7基因在去勢組顯著升高,提示去勢豬合成代謝明顯增強,這與去勢豬脂肪沉積增加的現象是一致的。

AQP7基因屬于甘油水孔蛋白亞類,位于脂肪細胞細胞膜上,當機體需要能量的時候,其主要將甘油從脂肪細胞內轉運至血液,其在脂肪代謝中具有關鍵的媒介作用[29]。本研究中,AQP7基因在2個組差異倍數僅次于FABP7,提示豬去勢后其雄性激素分泌減少能夠調控AQP7基因的表達水平。但雄性激素是直接調控FABP7還是通過轉化為雌激素間接調控，其具體調控機制還需進一步開展研究證明。

CYP7A1是PPAR信號通路下調倍數最高的基因,其是肝細胞膽汁酸合成經典途徑的限速酶,對調節膽固醇的分解代謝具有重要作用。此外,作為LXRα的靶基因,CYP7A1也參與糖脂代謝、能量平衡調控。遲靜等[30]發現CYP7A1基因多態性與中老年脂代謝紊亂相關,攜帶該基因突變型的個體發生脂代謝紊亂的風險更高。李萬貴等[31]揭示CYP7A1基因多態性與鴨肉質和脂肪性狀相關。張依裕等[32]研究證明CYP7A1基因c.759.T>A突變可以作為降低番鴨膽固醇的標記性輔助選擇位點。研究發現CYP7A1 mRNA在鵝肥肝中表達量低于普通肝臟,提示脂肪沉積越多的組織該基因表達越低[33]。這與本研究結果一致,去勢組與非去勢組相比,CYP7A1基因的|log2差異倍數|為-4.568,說明豬去勢后伴隨著脂肪沉積增加,CYP7A1表達量顯著下調。

PPARGC1α是PPARγ的核轉錄輔激活因子,其主要在線粒體含量豐富的組織中表達,例如棕色脂肪組織和肌肉組織,而在白色脂肪組織中表達量降低[34],所以本研究結果中PPARGC1α的FPKM值較低,尤其在去勢組其FPKM值僅為0.069,為PPAR信號通路中最低值。PPARGC1α通過與不同轉錄因子結合參與適應性產熱、線粒體的生物合成、肌纖維轉換、脂肪酸氧化等消耗能量的生物過程,本研究中與非去勢豬相比,去勢豬脂肪組織的分解代謝降低而合成代謝增高,所以該基因在非去勢組表達量更高。而PCK1(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)基因,其編碼的PEPCK酶不僅是糖異生過程的限速酶,還與甘油異生密切相關[35]。有研究發現,PCK1基因表達量增加導致肝臟葡萄糖合成增加,出現胰島素抵抗等Ⅱ型糖尿病癥狀,說明該基因在葡萄糖代謝穩態具有重要作用[36]。小鼠的肝臟特異性敲除PCK1基因后出現脂肪肝[37],說明該基因與脂肪沉積呈負相關,這與本研究結果一致,脂肪沉積增多的去勢豬PCK1基因表達量顯著低于非去勢組。

綜上所述,豬去勢后出現雄性激素缺乏導致的脂肪沉積增多,即脂肪的合成代謝大于分解代謝。在這個過程中,PPAR信號通路共有17個基因表達量發生顯著變化,其中14個上調,3個下調,差異基因|log2差異倍數|最大值為4.568,平均值為2.012,提示該信號通路在豬去勢肥育過程中起到關鍵作用。下一步研究需要明確雄性激素如何影響這些基因的表達。

參考文獻：

[1]卜鴻靜,岳磊,韻曉冬,等.引進豬種與我國地方豬種生產效率及肉質特性比較[J].山西農業科學,2014,42(1):74-77.

[2]豆成林.淮南豬肉品質特性研究[D].楊凌:西北農林科技大學,2008.

[3]豆成林,周楓.淮南豬、豫南黑豬和長白豬氨基酸組成及含量的分析與比較[J].食品工業,2013,34(9):200-202.

[4]呂妍,徐金娥.PPAR與糖尿病脂代謝的相關性[J].齊魯醫學雜志,2013,28(3):277-279.

[5]熊敏.PPARs調控家禽脂肪代謝的基因網絡研究[D].武漢:華中農業大學,2011.

[6]柳曉峰,李輝.PPAR基因與脂肪代謝調控[J].遺傳,2006,28(2):243-248.

[7]陳雪香,劉合焜.PPARα基因多態性與2型糖尿病關系研究[J].醫學綜述,2008,14(6):897-899.

[8]蔣金航,馬云,王新莊.PPARγ基因調控脂肪細胞分化的研究進展[J].中國畜牧雜志,2014,50(9):91-95.

[9]蔡兆偉,潘永明,陳亮,等.睪酮缺乏對高脂飲食小型豬血脂和肝內脂質沉積的影響[J].中國比較醫學雜志,2015,25(1):40-44,45.

[10]李密杰,張春梅,藍賢勇,等.共激活因子PGC-1α的研究進展[J].中國牛業科學,2012,38(4):35-38.

[11]Saigi-Morgui N,Vandenberghe F,Delacretaz A,etal.Association ofPCK1 with body mass index and other metabolic features in patients with psychotropic treatments[J].Journal of Clinical Psychopharmacology,2015,35(5):544-552.

[12]Bao L D,Li C Q,Peng R,etal.Correlation between the decrease of cholesterol efflux from macrophages in patients with type Ⅱ diabetes mellitus and down-regulatedCYP7A1 expression[J].Genetics and Molecular Research,2015,14(3):8716-8724.

[13]熊勝.鵝Lb-FABP基因克隆及填飼對鵝Lb-FABP、Apo-B和Apo-A1基因表達的影響[D].南京:南京農業大學,2013.

[14]潘虹,楊東英,陳宏.水-甘油通道蛋白7基因(AQP7)的研究進展[J].中國牛業科學,2012,38(5):53-57.

[15]黃萌,許尚忠,昝林森,等.牛RXRG基因cDNA的克隆及生物信息學分析[J].西北農林科技大學學報：自然科學版,2008,36(11):1-5,10.

[16]梁晶,王紅衛,程利安,等.北京黑豬PPARD基因G32E多態位點與脂肪沉積相關性狀的關聯分析[J].中國畜牧獸醫,2015,42(7):1793-1799.

[17]Joseph R,Poschmann J,Sukarieh R,etal.ACSL1 is associated with fetal programming of insulin sensitivity and cellular lipid content[J].Molecular Endocrinology,2015,29(6):909-920.

[18]Khaidakov M,Mitra S,Kang B Y,etal.OxidizedLDLreceptor1(OLR1)as a possible Link between obesity,dyslipidemia and cancer[J].PLoS One,2011,6(5):e20277,1-9.

[19]Johansson A,Curran J E,Johnson M P,etal.Identification ofACOX2 as a shared genetic risk factor for preeclampsia and cardiovascular disease[J].European Journal of Human Genetics,2011,19(7):796-800.

[20]Germain M,Pezzolesi M G,Sandholm N A,etal.SORBS1 gene,a new candidate for diabetic nephropathy:Results from a multi-stage genome-wide association study in patients with type 1 diabetes[J].Diabetologia,2015,58(3):543-548.

[21]Vernia S,Cavanagh-Kyros J,Garcia-Haro L A,etal.ThePPARalpha-FGF21 hormone axis contributes to metabolic regulation by the hepaticJNKsignaling pathway[J].Cell Metabolism,2014,20(3):512-525.

[22]Kozusko K,Tsang V H,Bottomley W,etal.Clinical and molecular characterization of a novelPLIN1 frameshift mutation identified in patients with familial partial lipodystrophy[J].Diabetes,2015,64(1):299-310.

[23]Wu Y R,Cun Y N,Jing Dong,etal.Polymorphisms inPPARD,PPARGandAPM1 associated with four types of Traditional Chinese Medicine constitutions[J].遺傳學報,2010(06):371-379.

[24]周鵬,張子平,王藝磊,等.大黃魚ubc9基因的克隆和組織表達[J].生物技術通報,2009(8):76-82.

[25]高曉娟,吉紅,常志光,等.PGC-1β和SREBP-1c在豬脂肪細胞分化過程中的相互作用[J].中國生物化學與分子生物學報,2011(06):533-539.

[26]吳丹.北京油雞體重和屠體性狀的全基因組關聯研究[D].北京:中國農業科學院,2012.

[27]方心靈,束剛,王松波,等.禁食及恢復采食狀態下雞能量代謝及下丘腦轉錄譜的比較[J].畜牧與獸醫,2012,44(S1):143.

[28]何侃,蔣越,王起山,等.基于芯片數據分析關于SREBP-1c調控脂肪代謝過程作用機理的研究[J].黑龍江畜牧獸醫,2010,23(13):1-4.

[29]Lebeck J.Metabolic impact of the glycerol channelsAQP7 andAQP9 in adipose tissue and liver[J].Journal of Molecular Endocrinology,2014,52(2):R165-R178.

[30]遲靜,翟成凱,郭延波,等.CYP7A1基因多態性對脂代謝異常人群影響[J].中國公共衛生,2013,29(4):491-493.

[31]李萬貴,張依裕,潘蘭兵,等.鴨CYP7A1基因編碼區C129T突變對肉質和脂肪性狀的遺傳效應分析[J].廣東農業科學,2012,39(24):158-160.

[32]張依裕,李萬貴,王單單.番鴨CYP7A1基因多態性對肉質和血清生化指標的效應研究[J].中國畜牧雜志,2015,51(11):5-9.

[33]邵丹,王來娣,張蕊,等.鵝肥肝形成相關基因的研究進展[J].中國畜牧獸醫,2012,39(9):42-46.

[34]尚進,靳燁.PPARGC1α基因與肉質品質相關性研究進展[J].肉類研究,2012,26(3):42-44.

[35]張澤賓.PCK1轉錄調控機制及功能性分子標記鑒定[D].石河子:石河子大學,2013.

[36]李劍虹,杜曉彤,劉火,等.冷刺激下AA肉雞PCK1基因的表達量[J].貴州農業科學,2014(8):142-146.

[37]董艷,張宏利,馮綺文,等.人PCK1基因克隆及其表達載體的構建[J].上海交通大學學報：醫學版,2006(2):135-137.

Effect of Castration on PPAR Signal Pathway Expression in Huainan Pig Subcutaneous Fat Tissue

WANG Jing1,BAI Xianxiao1,ZHANG Jiaqing1,GAO Binwen1,CHEN Junfeng1,GAO Yuan2,REN Qiaoling1,MA Qiang1,GUO Hongxia1,LIANG Yonghong1,XING Baosong1

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou450002,China;2.Xinxian Bureau of Animal Husbandry,Xinxian465550,China)

Abstract：To detect the role of PPAR signal pathway on the castration-induced fat deposition,RNA was isolated from the subcutaneous fat tissues of three castrated Huainan pigs and three intact Huainan pigs.The high-throughput sequencing approach was used to identify mRNA expression difference in castrated and intact pigs.The screening threshold for these genes was P value<0.05 and |log2FoldChange|>1.Based on the difference of the mRNA and the KEGG enrichment analysis,the expression of PPAR signal pathway was the highest in the castrated pigs,of which fourteen genes were upregulated and three genes were downregulated.Lipogenic genes like fatty acid binding protein 7 gene(FABP7),aquaporin 7 gene(AQP7),retinoid X receptor,gamma gene(RXRγ)were upregulated significantly in castrated pigs,and lipolysis genes were downregulated like phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 gene(PCK1),peroxisome proliferator-activated receptor gamma,coactivator 1 alpha gene(PPARGC1α)and cytochrome P450,family 7,subfamily A,polypeptide 1 gene(CYP7A1).

Key words:Huainan pig;Differential expression gene;High throughput sequencing;PPAR signal pathway;Fat deposition

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.016

中圖分類號：S828;Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0092-06

作者簡介：王璟(1985-),女,陜西潼關人,助理研究員,博士,主要從事動物遺傳育種研究。通訊作者：邢寶松(1969-),男,河南新密人,副研究員,博士,主要從事豬的育種與管理研究。

基金項目：河南省農業科學院自主創新基金項目(2015ZZ34)

收稿日期：2016-02-26