阿爾巴斯絨山羊iPSCs誘導及培養體系的優化

邰大鵬,乃門塔娜,諾明途,王　瀟,梁　浩,劉東軍

(內蒙古大學 哺乳動物生殖生物學及生物技術教育部重點實驗室,內蒙古 呼和浩特　010021)

?

阿爾巴斯絨山羊iPSCs誘導及培養體系的優化

邰大鵬,乃門塔娜,諾明途,王瀟,梁浩,劉東軍

(內蒙古大學 哺乳動物生殖生物學及生物技術教育部重點實驗室,內蒙古 呼和浩特010021)

摘要：阿爾巴斯絨山羊多潛能干細胞(giPSCs)在遺傳育種方面有重要的應用價值，然而目前還沒有完善的giPSCs誘導及培養體系。為了獲得穩定的giPSCs誘導及培養體系，根據培養基中添加的血清和小分子化合物的不同,構建了5組不同的培養基體系,分別觀察了giPSCs在不同培養基中的生長狀態、增殖能力以及重編程效率,并檢測了不同組giPSCs的多潛能性,最后分析了不同小分子化合物的組合對giPSCs重編程效率和干細胞標記基因表達的影響。結果發現,血清的添加更適合giPSCs的誘導培養,小分子化合物Vc、VPA和LiCL能有效促進giPSCs的生成和自我更新。這為完善而穩定的絨山羊iPSCs誘導培養體系的建立奠定了基礎,并且為阿爾巴斯絨山羊胚胎干細胞的建系提供了試驗平臺。

關鍵詞：阿爾巴斯絨山羊;iPSCs;誘導及培養基體系;小分子化合物

誘導性多潛能干細胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)是指把胚胎干細胞特異性轉錄因子導入成體細胞,使細胞重編程為類似于胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESCs)的多潛能干細胞[1]。iPSCs的誘導效率非常低,極易分化,因此對培養環境的要求非常高,需要飼養層細胞和細胞因子的輔助[2]。一個完善的誘導培養體系可有效提高iPSCs的誘導效率,并能維持其自我更新和增殖能力[3-4]。而其中添加的血清以及細胞因子是決定培養基功效的關鍵因素,極大地影響著培養基的功能,例如,培養基中添加LIF才能維持小鼠iPSCs的自我更新;無bFGF培養基不能維持人iPSCs的多潛能性[5-6]。但這些并不能解決重編程效率低的問題。

隨著iPS技術的迅猛發展,研究發現一些小分子化合物不僅可以提高iPSCs的重編程效率,而且能促進其自我更新和增殖能力[7]。它們有些是通過抑制組蛋白甲基化、促進乙酰化等途徑改變細胞的表觀遺傳狀態而促進細胞重編程;有些是通過調節胞內信號通路而促進細胞重編程。總之,他們使重編程細胞更接近ESCs,更好地激活內源的多能性基因,使得培養條件更加完善[8-10]。

阿爾巴斯絨山羊是我國優良家畜品種,建立穩定的阿爾巴斯絨山羊iPSCs體系不但可以為相關學科的發展提供理論依據,同時在其遺傳育種方面也具有十分重要的應用價值。然而,絨山羊iPSCs(Goat iPSCs,giPSCs)的誘導及建系非常困難,對其培養條件的探究也較少,所獲得的細胞或增殖速度過于緩慢,或很難維持多能性,且還沒有嵌合體的產生[11-13]。目前,人們普遍把人或小鼠ESCs培養體系直接應用于山羊ESCs和iPSCs中,但并沒有研究證實過這些培養體系完全適用于giPSCs的生成,更沒有驗證過giPSCs上是否有培養基中添加的細胞因子(例如:LIF、bFGF)的受體。這些因子是否有作用以及起什么作用都沒有被驗證過[14-15]。本試驗參考Vc(Vitamin C)、VPA(Valproic acid)和LiCl (Lithium chloride)等[16-19]小分子促進iPSCs重編程的相關報道,在培養基中添加不同的血清和小分子化合物,構建5組不同的培養基體系,優化giPSCs的誘導及培養條件,為建立完善而穩定的giPSCs培養體系提供試驗依據。

1材料和方法

1.1阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細胞(Goat fatal fibroblasts,GFFs)的培養

待阿爾巴斯絨山羊自然受孕40 d后,經手術從子宮中取出完整的羊胎兒(帶羊水),將胎兒在75%的乙醇中短暫浸洗消毒后剝除羊膜,用D-PBS(Hyclone)溶液清洗2～3遍。在超凈工作臺中,從初具雛形的胎兒背部剪下部分組織,在60 mm 培養皿中,用無菌眼科手術剪剪碎,加入0.05% Trypsin-EDTA(Gibco)消化5～7 min,加入含有10% FBS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)培養液終止消化。將懸液移入細胞培養皿中,置于恒溫細胞培養箱(37 ℃,5% CO2飽和濕度)中培養24 h后換液。后期培養中隔天換液,培養過程中經常觀察成纖維細胞生長狀態,待細胞長至皿底85%的匯合度時對細胞做傳代培養。

1.2飼養層的制備

鋪于100 mm培養皿的2～5代的絨山羊胎兒成纖維細胞待覆蓋皿底85%時,用終濃度為10 μg/mL的含有絲裂霉素C(MMC)的培養液處理細胞2～5 h。去除培養液,D-PBS清洗細胞5次,再用0.05% Trypsin-EDTA消化1 min,加入完全培養液終止消化,收集細胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入完全培養基,制成細胞懸液。對細胞懸液進行計數,調整細胞濃度,將細胞懸液以1.5×104～2.0×104個/cm2的密度接種于鋪有0.1%明膠(Sigma)的培養皿中,置于37 ℃恒溫細胞培養箱中培養24 h,即可接種干細胞。

1.3慢病毒載體的包裝及感染胎兒成纖維細胞

包被病毒的載體系統包括VS3G、gag及主載體(鼠源性的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)。100 mm培養皿中培養293T細胞,皿中85%的細胞匯合時做脂質體轉染。36 h后收集上清液,置于4 ℃冰箱,培養皿中再次加入10 mL 培養基,24 h后第2次收集上清。將2次上清毒液混合后,以1 000 r/min離心5 min,收集上清,用0.45 μm的濾器過濾,以1 mL/管凍存備用。

1.4慢病毒轉染阿爾巴斯絨山羊胎兒成纖維細胞

絨山羊胎兒成纖維細胞以5×104/孔的密度接種于24孔板中,加入1 mL 混合病毒培養液(病毒上清液Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc各150 μL,加400 μL培養基)培養24 h,重復感染3次。去除病毒混合液,D-PBS清洗細胞3次,0.05% trypsin-EDTA消化細胞后加入完全培養基終止消化,1 000 r/min離心5 min,做細胞計數,按每孔5×104的細胞數接種于鋪有飼養層的6孔板中,加入不同ESCs培養基繼續培養。

1.5堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)染色鑒定

阿爾巴斯絨山羊iPSCs傳代培養后的第8天,將待檢測的iPSCs 用PBS漂洗3次,加入4%多聚甲醛固定2～5 min,用PBS沖洗2次后加入預先混合調配好的AP染色工作液,常溫避光染色30 min后移去染色工作液,加入一定量的PBS后即可上鏡觀察。

1.6五組不同giPSCs培養基體系的設計

配置5組不同giPSCs培養基體系,培養基Ⅰ:20% KSR(Gibco)+Knock-out DMEM(Gibco)+0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol(Millipore)+1% NEAA(Nonessential amino acid,Gibco)+2 mmol/L glutaMAX(Gibco)+1 ng/mL mLIF;培養基Ⅱ:20% FBS(Gibco)+Knock-out DMEM+0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol+1% NEAA+2 mmol/L glutaMAX+1 ng/mL mLIF;培養基Ⅲ:20% FBS+Knock-out DMEM+0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol+1% NEAA+2 mmol/L glutaMAX+1 ng/mL mLIF+5 ng/mL Vc(Sigma);培養基Ⅳ:20% FBS+Knock-out DMEM+0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol+1% NEAA+2 mmol/L glutaMAX+1 ng/mL mLIF+5 ng/mL VPA(Sigma),病毒感染后的第5～12天用5 mmol/L的LiCL(Sigma)處理細胞;培養基Ⅴ:FBS+Knock-out DMEM+0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol+1% NEAA+2 mmol/L glutaMAX+1 ng/mL mLIF+5 ng/mL Vc+5 ng/mL VPA,第5～12天用LiCl處理細胞。28 d后統計酶5×104個細胞中AP陽性克隆數,用第5代的細胞做實時定量PCR檢測。

1.7干細胞標志基因的RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)和qPCR(Quantitative polymerase chain reaction)檢測

待新傳代的iPSCs生長至第7天,收取阿爾巴斯絨山羊iPSCs于無酶管中,依照“RNeasy Plus Micro Ki”(Qiagen)試劑盒說明書提取總RNA,用“Thermo Scientific”反轉錄試劑盒對總RNA進行反轉錄,獲得樣品的總cDNA。PCR反應體系:取總cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL(2 μmol/L);應體系:94 ℃預變性5 min；之后94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min共計30個循環；最后72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物(表1)。qPCR反應時取反轉錄物2 μL,正反向引物各,0.5 μL(2 μmol/L),SYBR Premix Ex Taq 10 μL。反應條件為95 ℃預變性30 s,之后95 ℃ 5 s;60 ℃ 31 s,共計40個循環,加溶解曲線(表2)。

表1　RT-PCR基因引物序列表

表2　qPCR基因引物序列表

1.8干細胞標記抗原的免疫熒光檢測

將iPSCs傳代接種于有蓋玻片的鋪好滋養層的24孔培養板中,待iPSCs生長至第7 天,可見iPSCs貼附于載玻片上生長,用D-PBS洗細胞3遍,4%多聚甲醛固定細胞30 min,再用0.1% Triton-X 100/PBS室溫通透10～15 min,然后用0.4% BSA/PBS 漂洗3次,每次6～8 min。每孔加入500 mL山羊封閉血清,30 min后去除封閉上清液,加入已配置好的一抗稀釋液(OCT4、SOX2、NANOG、 abcom)于4 ℃孵育過夜,次日去除剩余一抗液體,用0.4% BSA/PBS清洗3次,每次6～8 min。對應一抗分別加入相應的已配置好的二抗稀釋液(abcom)于室溫孵育1 h,棄去二抗上清,加入0.4% BSA/PBS清洗3次,每次5 min。最后加入DAPI(Sigma)染色劑稀釋液染色3 min,棄去剩余稀釋液,PBS清洗3次,小心取出蓋玻片后扣封蓋玻片于載玻片上,共聚焦顯微鏡下拍片觀察。

1.9類胚體形成(Embryoid bodies,EBs)的檢測

取生長狀態良好的iPSCs,用D-PBS漂洗2～3次,加入Accutase(Stem cell)消化液3～4 min,加入knoc kout DMEM+20% FBS的培養液終止消化,離心再加入培養基懸浮細胞使其形成單細胞懸液。60 mm培養皿蓋上滴細胞懸液后扣回皿蓋制作成懸滴。皿中添入適當的PBS緩沖液,懸滴培養 8～10 d后,收集懸滴觀察是否形成類胚體,并做RT-PCR檢測[20]。

2結果與分析

2.1giPSCs的產生及AP染色鑒定

GFFs經病毒3次感染后(即重編程第4 天),接入鋪有飼養層的培養皿中,加入5種不同的培養基誘導培養。在培養基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中,約感染后的第12天,可觀察到細胞形態產生改變,增殖速度增快,把細胞消化成單個細胞接種至新的飼養層上,約第18 天可見到山羊ESCs樣的克隆,即山羊誘導性多潛能干細胞(giPSCs、giPSCsⅠ、giPSCsⅡ、giPSCsⅢ)。giPSCs克隆呈橢圓,邊緣明顯,與小鼠ESCs相似。

重編程第23天,可見giPSCs克隆明顯增大,挑選部分克隆,Accutase酶消化成單個細胞后傳代擴增培養,約9 d傳代一次。giPSCsⅠ傳代極易分化,只能傳至4～5代;giPSCsⅡ傳代易分化,可傳至7～8代;giPSCsⅢ可以穩定傳至15代。對第23 天的giPSCs克隆AP染色后發現,giPSCsⅠ、giPSCsⅡ不易被染色,染色較淺,AP陽性克隆較少;giPSCsⅢ染色較深,AP陽性克隆較多(圖1-A、B、C,表3)。

在培養基Ⅳ、Ⅴ中,約重編程第15天,可見細胞形態改變,增殖速度加快,傳代換飼養層后,第23 天才可初次見到giPSCs克隆(giPSCsⅣ、giPSCsⅤ)。重編程第28 天,可見細胞克隆明顯增大,可挑選克隆并傳代擴增培養,約10 d傳代一次。對第25 天的giPSCs做堿性磷酸酶染色后發現,giPSCsⅣ、giPSCsⅤ易被染色,染色較深,AP陽性克隆多。giPSCsⅣ和giPSCsⅤ均可傳至15代以上,克隆形態清晰,邊緣整齊不易分化(圖1-D、E、表3)。

A1.重編程后第18 天的giPSCsⅠ克隆;A2.重編程后第23天的giPSCsⅠ克隆;A3.第5代已分化的giPSCsⅠ克隆;A4.重編程后第23 天的AP陽性giPSCsⅠ克隆；B1.重編程后第18天的giPSCsⅡ克隆;B2.重編程后第23天的giPSCsⅡ克隆;B3.第7代已分化的giPSCsⅡ克隆;B4.重編程后第23天的AP陽性giPSCsⅡ克隆；C1.重編程后第18天的giPSCsⅢ克隆;C2.重編程后第23天的giPSCsⅢ克隆;C3.第15代的giPSCsⅢ克隆;C4.重編程后第23 天的AP陽性giPSCsⅢ克隆；D1.重編程后第23天的giPSCsⅣ克隆;D2.重編程后第28 天的giPSCsⅣ克隆;D3.第15代的giPSCsⅣ克隆;D4.重編程后第28天的AP陽性giPSCsⅣ克隆；E1.重編程后第23天的giPSCsⅤ克隆;E2.重編程后第28天的giPSCsⅤ克隆;E3.第15代的giPSCsⅤ克隆;E4.重編程后第28天的AP陽性giPSCsⅤ克隆。標尺,200 μm。

A1.The reprogrammed giPSCsⅠon day 18;A2.The reprogrammed giPSCsⅠon day 23;A3.The differentiated giPSCsⅠon passage of 5;A4.The AP positive giPSCsⅠon day 23.B1.The reprogrammed giPSCsⅡon day 18;B2.The reprogrammed giPSCsⅡon day 23;B3.The differentiated giPSCsⅡon passage of 7;B4.The AP positive giPSCsⅡon day 23.C1.The reprogrammed giPSCsⅢon day 18;C2.The reprogrammed giPSCsⅢon day 23;C3.The giPSCsⅢon passage of 15;C4.The AP positive giPSCsⅢon day 23.D1.The reprogrammed giPSCsⅣon day 23;D2.The reprogrammed giPSCsⅣon day 28;D3.The giPSCsⅣon passage of 15;D4.The AP positive giPSCsⅣon day 28.E1.The reprogrammed giPSCsⅤon day 23;E2.The reprogrammed giPSCsⅤon day 28;E3.The giPSCsⅤon passage of 15;E4.The AP positive giPSCsⅤon day 28.Scale bars,200 μm.

圖1giPSCs的生成

Fig.1The generation of giPSCs

2.2giPSCs克隆形成率的統計

病毒感染后的細胞分別培養于培養基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中,28 d后統計每5×104個細胞中AP陽性克隆數。結果發現,培養基Ⅰ中培養的細胞可平均形成(4.6±1.2)個陽性克隆。培養基Ⅱ中培養的細胞可平均形成(10.3±2.1)個陽性克隆。培養基Ⅲ中培養的細胞可平均形成(17.5±1.3)個陽性克隆。培養基Ⅳ的培養的細胞可平均形成(24.8±2.1)個陽性克隆。培養基Ⅴ中培養的細胞可形成平均(28.9±0.8)個陽性克隆(表3、圖2)。綜合上述結果,培養基Ⅴ比較適合誘導培養giPSCs。

表3　giPSCs生成統計表

圖2　不同培養基中AP陽性giPSCs克隆的統計

2.3giPSCs的多潛能性標記基因的RT-PCR及實時定量PCR檢測

收集第3代的不同培養基中生成的giPSCs,提取總RNA做RT-PCR檢測。結果顯示,giPSCsⅠ、giPSCsⅡ、giPSCsⅢ、giPSCsⅣ、giPSCsⅤ中均有外源性基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和內源基因OCT4、SOX2、NANOG和KLF4的表達。電泳結果揭示,5組giPSCs中外源基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc均高表達,每組間的表達差異不大。內源基因的表達上,giPSCsⅠ、giPSCsⅡ中的內源基因OCT4、SOX2、NANOG和KLF4的表達明顯低于其他3組(圖3)。

對第3代不同組的giPSCs分別做實時定量PCR,檢測干細胞標記基因OCT4、SOX2、NANOG和KLF4的表達水平,以GFFs為陰性對照。結果發現,giPSCsⅠ中4種基因的表達量非常低,其中OCT4和NANOG的表達水平特別低,這與其易分化相應。giPSCsⅡ中各基因的表達量雖有提高,但還是處于低表達水平,giPSCsⅡ仍不能長期傳代培養。giPSCsⅢ中4種基因的表達量均高于前2組。giPSCsⅣ中各基因的表達量均顯著高于iPSCsⅡ中的,并高于giPSCsⅢ中的表達,其中OCT4和SOX2基因的表達水平提高得非常顯著。giPSCsⅤ中基因OCT4、SOX2、NANOG的表達量均高于其他4組(圖4)。由此認為,培養基Ⅴ適合giPSCs的誘導及培養。

圖3　giPSCs的多能性標記基因的RT-PCR檢測

2.4giPSCs的免疫熒光檢測

采用細胞免疫熒光檢測第5代的giPSCsⅡ、giPSCsⅢ、giPSCsⅣ、giPSCsⅤ克隆的胚胎干細胞特性標記蛋白。結果顯示,4組giPSCs中,胚胎干細胞特性標記蛋白OCT4、SOX2、NANOG均呈陽性。這表明giPSCsⅡ～Ⅴ均已有ESCs的多能性標記蛋白的表達,具有多潛能性(圖5)。

圖4　giPSCs的OCT4、SOX2、NANOG和 KLF4等基因的qPCR檢測

標尺,100 μm。圖6同。Scale bars,100 μm.The same as Tab.6.

2.5giPSCs的類胚體形成

用無mLif、Vc、VPA的培養基懸浮培養第5代的giPSCsⅡ、giPSCsⅢ、giPSCsⅣ、giPSCsⅤ,8 d后可見類胚體細胞團(圖6)。RT-PCR檢測結果顯示EBs中分別有內胚層標記基因SOX17,外胚層標記基因MEF2C和中胚層標記基因PAX6的表達。這顯示所形成的類胚體具有三胚層分化,即giPSCsⅡ～Ⅴ體外均有多向分化潛能(圖7)。

3討論

體外維持多潛能干細胞的多潛能性和自我更新的分子機制一直是研究熱點,也正是對其機制的不了解成為誘導和培養iPSCs的阻礙[21-23]。而且,與其ESCs相似,iPSCs的形態、增殖能力和相應的分子機制也有種屬差異[24]。比如人和小鼠的iPSCs的形態和自我更新的分子機制都有明顯的差異。相比于人和小鼠,giPSCs比較難獲得,其相關分子機制的研究更是甚少。目前還未建立針對絨山羊ESCs和iPSCs的培養基體系。

A.giPSCsⅡ自分化形成的EBs;B.giPSCsⅢ自分化形成的EBs;C.giPSCsⅣ自分化形成的EBs;D.giPSCsⅤ自分化形成的EBs。

A.The giPSCs Ⅱ differentiated into Embryoid bodies;B.The giPSCs Ⅲ differentiated into Embryoid bodies;C.The giPSCs Ⅳ differentiated into Embryoid bodies;D.The giPSCs Ⅴ differentiated into Embryoid bodies.

圖6giPSCs分化形成三胚層分化的類胚體形成圖

Fig.6The giPSCs differentiated into Embryoid

bodies of all three germ layersinvitro

圖7　EBs的三胚層標記基因的RT-PCR檢測

對于常規細胞的體外培養,血清是不可或缺的培養基成分之一。然而,血清的成分不明確,容易引起多潛能干細胞的分化。這影響著血清在干細胞培養中的應用。目前,人和小鼠的iPSCs誘導培養中大多使用成分明確的無血清培養基。由于對絨山羊ESCs和iPSCs的研究較少,其分子機制不清楚,giPSCs的誘導培養基還不能缺少血清。本試驗中也發現,血清替代物或無血清培養基還不能滿足giPSCs的體外培養條件,這可能是因為血清中存在不知名成分對iPSCs的誘導培養起到關鍵作用[12,20]。本研究中所獲得的giPSCs形態上與小鼠ESCs相似,同時發現,與小鼠ESCs培養條件相似的培養基體系更適合誘導培養giPSCs。研究發現,giPSCs的培養基體系中必須要添加LIF因子。LIF能有效抑制giPSCs的分化,并維持其自我更新,而bFGF并沒有明顯的作用。

近年來,越來越多的研究報道一些小分子化合物,如抗氧化劑、甲基化抑制劑及信號通路抑制劑顯著提高重編程效率,有效維持iPSCs的多能性[7,25-26]。現有報道只用小分子化合物能夠誘導小鼠成纖維細胞重編程形成iPSCs[27]。本研究選擇了Vc、VPA和LiCL 3種小分子,對giPSCs的重編程條件進行優化。其中,Vitamin C是有機小分子,可以抗細胞衰老,降低細胞中活性氧的水平[16],從而提高重編程效率;VPA是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑,它可以提高某些基因的乙酰化水平,從而提高基因的表達水平[18];LiCL鹽中的Li+是一種治療神經紊亂疾病的藥物,可以調節一些胞內信號通路來提高重編程效率[19]。

本試驗中發現,Vc和VPA能有效提高giPSCs的重編程效率,提高內源的干細胞標記基因的表達水平。另外,與Vc相比,VPA能顯著提高內源基因OCT4和SOX2的表達水平,而對基因KLF4和c-MYC并沒有特別明顯的作用。LiCl的作用與VPA相似,對基因OCT4和SOX2的作用明顯。因此,將二者協同應用在同一種培養基中,其重編程效果優于只添加Vc的培養基。然而,培養基中添加VPA和LiCL,雖然增強了giPSCs的自我更新能力,卻延長了細胞的重編程時間,所幸沒有影響到giPSCs的增殖能力。本試驗未能解釋清楚此類現象的原因。另外,對giPSCs的傳代培養過程中,并未撤去培養基中的VPA,這未影響giPSCs的狀態及多潛能性。此舉有別于Huangfu等[18]的報道。由于LiCL對細胞具有毒性,不能長期添加于培養基中。因此,在誘導培養過程中需要階段性的添加LiCl,而傳代培養過程中并不需要添加。在giPSCs誘導培養基中同時添加 Vc、VPA和LiCL,并未發現3種小分子之間相互抑制現象,三者之間具有較好的協同效果,能有效提高giPSCs的重編程效率。本試驗中,我們雖然未能得到Esteben、Huangfu和Wang等[17-19]報道那樣如此高的重編程效率,這也許與giPSCs誘導培養基體系遠未達到完善的程度有關系,還是明顯優化了giPSCs的誘導培養環境,為以后的相關研究提供了有益數據。

參考文獻：

[1]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[2]Yu Jun-ying,Vodyanik M A,Smuga-otto K A,et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells[J].Science,2007,318(5858):1917-1920.

[3]Evans M J,Kaufman M H.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature,1981,292(5819):154-156.

[4]Matsui Y,Zsebo K,Hogan B L.Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture[J].Cell,1992,70(5):841-847.

[5]Chen Shuibing,Do J T,Zhang Qisheng,et al.Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006,103(46):17266-17271.

[6]Li Yanjun,Mcclintick J,Zhong Li,et al.Murine embryonic stem cell differentiation is promoted by SOCS-3 and inhibited by the Zinc finger transcription factor Klf4[J].Blood,2005,105(2):635-637.

[7]Efe J A,Ding Sheng.The evolving biology of small molecules:controlling cell fate and identity[J].Philosophical Transactions of the Royal Society of London.Series B,Biological Sciences,2011,366(1575):2208-2221.

[8]Mikkelsen T S,Hanna J,Zhang Xiaolan,et al.Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis[J].Nature,2008,454(720):49-55.

[9]Kelly R D,Sumer H,Mckenzie M,et al.The effects of nuclear reprogramming on mitochondrial DNA replication[J].Stem Cell Reviews,2013,9(1):1-15.

[10]Shi Yan,Do J T,Desponts C,et al.A combined chemical and genetic approach for the Generation of induced pluripotent stem cells[J].Cell Stem Cell,2008,2(6):525-528.

[11]Behboodi E,Bondareva A,Begin I,et al.Establishment of goat embryonic stem cells frominvivoproduced blastocyst-stage embryos[J].Molecular Reproduction and Development,2011,78(3):202-211.

[12]Ren Jiangtao,Pak Y,He Lixiazi,et al.Generation of hircine-induced pluripotent stem cells by somatic cell reprogramming[J].Cell Research,2011,21(5):849-853.

[13]Song Hui,Li Hui,Huang Mingrui,et al.Induced pluripotent stem cells from goat fibroblasts[J].Molecular Reproduction and Development,2013,80(12):1009-1017.

[14]Pant D,Keefer C.4 gene expression in cultures of inner cell masses isolated from in vitro produced andinvivo-derived bovine blastocysts[J].Reproduction Fertility&Development,2005,18(9):110-110.

[15]Keefer C L,Pant D,Blomberg L,et al.Challenges and prospects for the establishment of embryonic stem cell lines of domesticated ungulates[J].Animal Reproduction Science,2007,98(1/2):147-168.

[16]Esteban M A,Wang Tao,Qin Baoming,et al.Vitamin C enhances the Generation of mouse and human induced pluripotent stem cells[J].Cell Stem Cell,2010,6(1):71-79.

[17]Esteban M A,Pei Duanqing.Vitamin C improves the quality of somatic cell reprogramming[J].Nature Genetics,2012,44(4):366-367.

[18]Huangfu Danwei,Osafune K,Maehr R,et al.Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2[J].Nature Biotechnology,2008,26(11):1269-1275.

[19]Wang Quan,Xu Xinxiu,Li Jun,et al.Lithium,an anti-psychotic drug,greatly enhances the Generation of induced pluripotent stem cells[J].Cell Research,2011,21(10):1424-1435.

[20]Li Yang,Cang Ming,Lee A S,et al.Reprogramming of sheep fibroblasts into pluripotency under a drug-inducible expression of mouse-derived defined factors[J].PLoS One,2011,6(1):e15947.

[21]Reya T,Duncan A W,Ailles L,et al.A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells[J].Nature,2003,423(6938):409-414.

[22]Sato N,Meijer L,Skaltsounis L,et al.Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor[J].Nature Medicine,2004,10(1):55-63.

[23]Butler J M,Nolan D J,Vertes E L,et al.Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells[J].Cell Stem Cell,2010,6(3):251-264.

[24]Ying Q L,Wray J,Nichols J,et al.The ground state of embryonic stem cell self-renewal[J].Nature,2008,453(7194):519-523.

[25]Zhu Saiyong,Ma Tianhua,Li Jun,et al.Recent advances in chemically induced reprogramming[J].Cell Cycle(Georgetown,Tex.),2011,10(6):871-872.

[26]Chen Shuibing,Takanashi S,Zhang Qisheng,et al.Reversine increases the plasticity of lineage-committed mammalian cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2007,104(25):10482-10487.

[27]Li Xiang,Zuo Xiaohan,Jing Junzhan,et al.Small-Molecule-Driven direct reprogramming of mouse fibroblasts into functional neurons[J].Cell Stem Cell,2015,17(2):195-203.

Optimization of Induced and Cultivation System of Arbas Cashmere Goat iPSCs TAI Dapeng,Naimentana,NUO Mingtu,WANG Xiao,LIANG Hao,LIU Dongjun

(Key Laboratory of Education Ministry of China for Research of Mammal Reproductive

Biology and Biotechnology,Inner Mongolia University,Huhhot010021,China)

Abstract：The induced pluripotent stem cells of Arbas cashmere goats (giPSCs) have significant values in genetic breeding,however,nowadays there are no compatible induced and cultivation medium systems of giPSCs.In order to establish a stable and complete induced and cultivation medium system,In this study,we showed that five different cultivation medium systems with different combination of serum and small molecules were able to generate the giPSCs.The growth status,subculture ability and reprogramming efficiency of giPSCs which derived from five different cultivation medium systems were observed,and pluripotency of these giPSCs was detected.At last,the influence of different combinations of small moleculars on the reprogramming efficiency and expression of pluripotent genes of giPSCs were analyzed.We found that serum promoted the generation of giPSCs and Vc,VPA and LiCL could accelerate the generation and self renewal of giPSCs.The research provided foundation for further study on stable and complete induced cultivation medium system of Arbas cashmere goat iPSCs,and experimental platform for embryonic stem cell line of Arbas cashmere goats.

Key words:Arbas cashmere goat;iPSCs;Induced and cultivation medium system;Small molecules

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.018

中圖分類號：S826

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)02-0106-08

作者簡介：邰大鵬(1984-),男,內蒙古興安盟人,博士,主要從事哺乳動物生殖生物學與生物技術研究。通訊作者：劉東軍(1963-),男,內蒙古烏蘭察布人,教授,博士,博士生導師,主要從事哺乳動物生殖生物學與生物技術研究。

基金項目：轉基因生物新品種培育重大專項(2011ZX08008-002)

收稿日期：2016-02-16