芽孢桿菌Pb-4菌株鑒定及其抑菌活性的研究

郭　珺,武愛蓮,閆　敏 ,李　娓,池秀蓉,丁玉川 ,焦曉燕

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院　農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所,山西省土壤環(huán)境與養(yǎng)分資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原　030031;2.北京市種子管理站,北京　100088)

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芽孢桿菌Pb-4菌株鑒定及其抑菌活性的研究

郭珺1,武愛蓮1,閆敏1,李娓1,池秀蓉2,丁玉川1,焦曉燕1

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所,山西省土壤環(huán)境與養(yǎng)分資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原030031;2.北京市種子管理站,北京100088)

摘要：拮抗菌Pb-4是一株對(duì)多種植物病原菌有較強(qiáng)抑制作用的菌株。為了明確拮抗菌Pb-4的分類地位和抑菌機(jī)理,通過形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rRNA 基因序列同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析,對(duì)Pb-4菌株進(jìn)行鑒定。并采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定Pb-4菌株的抑菌譜,顯微觀察其抑菌作用,采用硫酸銨沉淀和乙醚、苯提取得到抑菌活性物。通過加熱處理,明確高溫對(duì)Pb-4菌株抑菌活性的影響。結(jié)果表明,Pb-4菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌;Pb-4菌株對(duì)番茄枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌、辣椒疫霉病菌、蘋果腐爛病菌均有抑制作用,其抑菌活性具有廣譜性。該菌菌液能明顯抑制枯萎病菌孢子的萌發(fā),并對(duì)病菌菌絲有致畸作用;對(duì)番茄枯萎病菌的抑制生長(zhǎng)率達(dá)93%,經(jīng)100,121 ℃高溫處理后的抑菌活性分別是未處理菌液的98.9%和80.1%。從菌液中提取的蛋白、酶、抗生素類活性物質(zhì)對(duì)枯萎病菌的生長(zhǎng)繁殖均有很強(qiáng)的抑制效果。為Pb-4菌株在病原菌防治中的廣泛應(yīng)用提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;枯萎病;拮抗菌;抑菌活性

枯萎病菌屬于尖孢鐮刀菌屬(FusariumOxysporumon),是真菌中一個(gè)龐大的家族,它們普遍存在于土壤及動(dòng)植物體內(nèi),常常導(dǎo)致蔬菜、瓜類、花卉等植物幼苗及成株枯萎與死亡,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前,防治枯萎病的方法主要有抗病品種選育、輪作、土壤消毒(物理防治)以及化學(xué)防治和生物防治等[2]。其中,抗病品種選育周期長(zhǎng),且抗病性與農(nóng)藝性狀很難兼顧;由于農(nóng)戶的耕作和栽培習(xí)慣,輪作在實(shí)際生產(chǎn)中也很難實(shí)現(xiàn);土壤消毒這一物理防治措施在實(shí)施過程中,將病原菌殺滅的同時(shí)也將土壤中的有益微生物菌群一同殺滅,而未取得有效的防治效果;使用化學(xué)農(nóng)藥防治會(huì)使病原菌對(duì)化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗藥性,且農(nóng)藥殘留則會(huì)引起土壤和地下水的污染以及對(duì)有益微生物種群的破壞;而隨著人們環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng),生物防治因其具有對(duì)環(huán)境、生態(tài)和人類健康安全的優(yōu)勢(shì),在世界各國(guó)得到了廣泛的重視,并在發(fā)揮著越來越重要的作用[3]。

利用有益微生物防治植物病害始于1921年,90多年來可防治植物病害的微生物已涉及真菌、放線菌、細(xì)菌乃至病毒(噬菌體)等很多種群[4-5]。目前,應(yīng)用廣泛的有蘇云金桿菌、枯草芽孢桿菌等產(chǎn)芽孢的桿狀細(xì)菌。芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)微生物種群,能產(chǎn)生多種抑制植物病原真菌的抗菌物質(zhì),且其極易繁殖,適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng),具有很強(qiáng)的抗逆能力和抗菌防病作用,對(duì)人畜無害,不污染環(huán)境,因而,在生物防治植物病害中起著重要的作用[6-7]。許多性狀優(yōu)良的天然分離菌株已被成功地應(yīng)用于植物病害的生物防治[4],但由于番茄、黃瓜等設(shè)施蔬菜枯萎病的專一性,目前研究的還較少。高芬等[8]研究了蠟質(zhì)芽孢桿菌對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑菌作用,閆敏[9]研究了木霉對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑菌活性。經(jīng)多年試驗(yàn)研究,山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所設(shè)施土壤生態(tài)活性調(diào)理劑研制課題組成功地分離得到一株對(duì)多種枯萎病菌有極強(qiáng)抑制作用的芽孢桿菌Pb-4菌株,通過鑒定為解淀粉芽孢桿菌,而目前利用解淀粉芽孢桿菌抑制番茄枯萎病菌的研究尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)研究了Pb-4菌株發(fā)酵液與抑菌粗提物對(duì)番茄枯萎病菌的抑菌特性,旨在為有效防治蔬菜枯萎病提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

拮抗菌:芽孢桿菌Pb-4由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所設(shè)施土壤生態(tài)活性調(diào)理劑研制課題組分離保存。病原菌:番茄枯萎病菌fq由本課題組從日光溫室自然發(fā)病株分離并經(jīng)回接鑒定;西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所提供;黃瓜枯萎病菌、辣椒疫霉病菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)菌種保藏中心提供；蘋果腐爛病菌由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供;培養(yǎng)基[10]:NA 培養(yǎng)基;PDA 培養(yǎng)基;NB 液體培養(yǎng)基;PYG 液體培養(yǎng)基;β-1,3-葡聚糖培養(yǎng)基。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1拮抗菌株鑒定菌株的形態(tài)及生理生化特性:對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定[11-12]。

菌株16S rRNA 分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建:16S rRNA 的PCR 擴(kuò)增[13],采用SDS加溶菌酶裂解法提取Pb-4菌株的基因組DNA;選用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGT TACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14],委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所得序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性分析和多序列比對(duì),根據(jù)比對(duì)結(jié)果應(yīng)用MEGA軟件、Neighbor-Jionig法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2拮抗菌Pb-4抑菌譜的測(cè)定利用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定Pb-4菌株對(duì)植物病原菌的抑菌活性[15-16]。

1.2.3拮抗菌Pb-4菌液對(duì)番茄枯萎病菌fq孢子及菌絲的抑制[17-21]將番茄枯萎病菌fq在PDA液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)72 h,菌液用滅菌的4層紗布過濾,制成孢子懸浮液,稀釋至孢子含量為1×106個(gè)/mL,按1∶1的體積比加入到菌含量為1×108個(gè)/mL的Pb-4菌菌液中,28 ℃靜置培養(yǎng),48 h及72 h后鏡檢,400倍顯微鏡下觀察Pb-4菌對(duì)fq孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的影響,對(duì)照為不加Pb-4菌菌液的fq孢子懸浮液。

1.2.4拮抗菌Pb-4不同處理菌液對(duì)番茄枯萎病菌fq的抑菌活性研究[20-25]Pb-4菌活體培養(yǎng)液的制備:將活化24 h的拮抗菌Pb-4菌液接種于NB液體培養(yǎng)基中,接種量為3%,置28 ℃,150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h,編號(hào)為0號(hào)菌液。

Pb-4菌上清液的制備:將Pb-4菌活體培養(yǎng)液置于滅菌的離心管中,在4 ℃條件下轉(zhuǎn)速為10 000 r/min離心10 min,將上清液收集在無菌三角瓶中備用,編號(hào)為1號(hào)菌液。

拮抗菌熱處理培養(yǎng)液的制備:將Pb-4菌活體培養(yǎng)液分別置于100 ℃水浴和121 ℃高壓滅菌處理20 min,編號(hào)分別為2號(hào)菌液和3號(hào)菌液。

平板制備:在無菌培養(yǎng)皿中分別加入1,2 mL以上4種菌液,隨后將冷卻至約45 ℃熔融態(tài)的PDA固體培養(yǎng)基倒平板,搖勻。同時(shí)以不接種Pb-4菌的液體培養(yǎng)基與PDA固體培養(yǎng)基混合倒成的平板為對(duì)照,各設(shè)3次重復(fù)。

抑制生長(zhǎng)率測(cè)定:待上述平板冷凝后接入預(yù)先培養(yǎng)5 d的直徑為0.6 cm的fq菌塊,倒置28 ℃溫箱中培養(yǎng),分別在1,3,5,7 d觀察并記錄fq菌落大小(以cm計(jì))。采用生長(zhǎng)速率法計(jì)算不同處理的抑制生長(zhǎng)率。

抑制生長(zhǎng)率(R1)=((對(duì)照菌落直徑-0.6)-(處理菌落直徑-0.6))/(對(duì)照菌落直徑-0.6)×100%。

相對(duì)抑菌活性測(cè)定:在滅菌后的培養(yǎng)皿中加入1 mL的fq菌液,隨后將冷卻至約45 ℃熔融態(tài)的PDA固體培養(yǎng)基倒入平板,搖勻,待凝固后將蘸有0,1,2,3號(hào)菌液20 μL的濾紙片以對(duì)角線方向貼于fq平板上,同時(shí)將蘸有無菌培養(yǎng)液的濾紙片貼于平板中心作為空白對(duì)照,28 ℃培養(yǎng)。然后,在1,3,5,7 d 觀察并記錄抑菌圈直徑,檢測(cè)其對(duì)fq的抑菌活性,以未經(jīng)熱處理的0號(hào)菌液為對(duì)照,計(jì)算1,2,3號(hào)菌液的相對(duì)抑菌活性。將0號(hào)活體培養(yǎng)液的抑菌活性定為100%。

相對(duì)抑菌活性(R2)=處理抑菌圈直徑/0號(hào)活體培養(yǎng)液抑菌圈直徑×100%。

1.2.5拮抗菌Pb-4抗菌蛋白粗提液的制備及抗菌活性鑒定[26-31]采用硫酸銨沉淀法提取拮抗菌Pb-4菌的拮抗物質(zhì)。將斜面活化的Pb-4菌接種到裝有50 mL NB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,28 ℃培養(yǎng)48 h,15 000 r/min離心15 min,得上清液;在上清液中加入粉狀硫酸銨,使硫酸銨飽和度達(dá)到80%,4 ℃冰箱過夜。次日,10 000 r/min離心15 min,棄上清,用適量的Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L,pH值7.5)溶解沉淀。然后用同一緩沖液4 ℃條件下透析48 h,PEG 6000濃縮,制得蛋白粗提液;將蛋白粗提液經(jīng)100,121 ℃處理后,對(duì)fq的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定;并將蛋白粗提液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,初步確定抗菌蛋白分子量。

1.2.6拮抗菌Pb-4非蛋白性拮抗物的提取及抑菌活性研究[9]按3%的接種量將Pb-4菌加入NB培養(yǎng)基中,28 ℃搖瓶培養(yǎng)48 h后,10 000 r/min離心10 min,取上清液分別加入等體積的乙醚、苯,封閉并劇烈振蕩,靜置。取有機(jī)相于三角瓶中,重復(fù)2～3次,待有機(jī)物揮發(fā)干凈后,取殘留物用無水乙醇溶解,進(jìn)行活性檢測(cè)。對(duì)應(yīng)地將無水乙醇、乙醚、苯作為對(duì)照,與提取的活性物質(zhì)采用瓊脂平板擴(kuò)散法觀察抑菌活性。

1.2.7拮抗菌Pb-4 β-1,3-葡聚糖酶活性的確定[32]β-1,3-葡聚糖酶可以分解病原菌菌絲體中的葡聚糖,從而達(dá)到抑制病原菌生長(zhǎng)的目的。將拮抗菌Pb-4接種于β-1,3-葡聚糖培養(yǎng)基上,觀察菌株生長(zhǎng)及培養(yǎng)基水解情況;并將Pb-4菌連接引物,進(jìn)行β-1,3-葡聚糖酶基因的PCR擴(kuò)增,通過SDS-PAGE凝膠電泳,初步確定Pb-4菌β-1,3-葡聚糖的酶活性。

引物序列為:正向5′-AATTCCATGGATGTTTT ATCGTATGAAACG-3′,反向5′-AATTGGATCCTTATT TTTTTGTATAGCGCAC-3′。

PCR 條件為:96 ℃預(yù)變性50 s;94 ℃變性50 s,56 ℃退火2 min,72 ℃延伸1.5 min,30個(gè)循環(huán)。

2結(jié)果與分析

2.1Pb-4菌株的分類鑒定

2.1.1Pb-4菌株的形態(tài)特征菌體呈桿狀,長(zhǎng)為3.0～3.3 μm,寬為1.0～1.2 μm,革蘭氏染色陽(yáng)性,好氧,內(nèi)生芽孢;在NA培養(yǎng)基上形成乳白色不透明菌落,生長(zhǎng)初期表面平滑凸起、濕潤(rùn)飽滿,后期干燥有褶皺,表面粗糙,菌落邊緣不整齊;在液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)時(shí),表面形成白色菌膜。

2.1.2Pb-4菌株的生理生化特征Pb-4菌株葡萄糖發(fā)酵、淀粉水解、明膠液化、V.P反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、硝酸鹽還原等試驗(yàn)均為陽(yáng)性,可在pH值6.0～9.0條件下生長(zhǎng),適宜生長(zhǎng)溫度為25～39 ℃。

2.1.316S rRNA 序列測(cè)定及分析Pb-4菌株的16S rRNA 長(zhǎng)度為1 450 bp,在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)結(jié)果顯示,其屬芽孢桿菌屬,與解淀粉芽孢桿菌聚為一群,具有99%的相似性;根據(jù)比對(duì)結(jié)果,用MEGA軟件、Neighbor-Jionig法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征,鑒定Pb-4菌株為解淀粉芽孢桿菌。

2.2Pb-4菌株的抑菌廣譜性

采用對(duì)峙培養(yǎng)方法確定抑菌廣譜的結(jié)果如表1所示。由表1可知,Pb-4菌株對(duì)番茄枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌、辣椒疫霉病菌、蘋果腐爛病菌均有抑制作用,其抑菌活性具有廣譜性。

圖1　Pb-4菌株 16S rRNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

病原菌Pathogens抑菌圈直徑/mmThediameterofinhibitionzone番茄枯萎病菌F.oxysporumtomato38.14±0.96黃瓜枯萎病菌F.oxysporumcucumber33.40±0.90西瓜枯萎病菌F.oxysporumwatermelon37.20±0.70青椒枯萎病菌F.oxysporumgreenpepper32.54±0.97辣椒疫霉病菌PhytophthoracapsiciLeo-nian36.80±0.60蘋果腐爛病菌Valsaceratosperma30.25±0.91

2.3Pb-4菌對(duì)番茄枯萎病菌孢子及菌絲的抑制作用

在400×光學(xué)顯微鏡下觀察顯示,對(duì)照孢子萌發(fā)正常,形成大量菌絲,菌絲修長(zhǎng)、光滑(圖2-A);Pb-4菌處理枯萎病菌孢子48 h后,孢子及菌絲產(chǎn)生了明顯變化,孢子數(shù)量較對(duì)照明顯減少,萌發(fā)的芽管變畸形,細(xì)胞頂端或中部膨大,形成圓形或不規(guī)則大泡囊,有的孢子被溶解,視野中有孢子破損痕跡和孢子殘存物,菌絲扭曲老化,提早產(chǎn)生厚垣孢子、菌絲斷裂(圖2-B)。

2.4Pb-4菌不同處理后菌液對(duì)番茄枯萎病菌的平皿抑菌活性測(cè)定結(jié)果

通過觀察并記錄番茄枯萎病菌菌落大小及不同菌液貼片抑菌圈的大小,從表2,3可以看出,隨著拮抗菌Pb-4菌與枯萎病菌相互作用時(shí)間的延長(zhǎng),抑制效果逐步提高;抑制生長(zhǎng)率隨著Pb-4菌添加量的增加而提高,其中,當(dāng)菌液量為2 mL時(shí)，Pb-4菌的活體培養(yǎng)液的抑制生長(zhǎng)率最高,達(dá)93%;100 ℃熱處理菌液抑制生長(zhǎng)率僅次于活體培養(yǎng)液,為91.1%,其相對(duì)抑菌活性達(dá)98.9%;121 ℃熱處理菌液抑制生長(zhǎng)率也在80%以上,相對(duì)抑菌活性達(dá)80.1%;而離心后上清液的抑制生長(zhǎng)率較低,其相對(duì)抑菌活性為66.4%。根據(jù)表2,3結(jié)果可以初步認(rèn)為,Pb-4菌對(duì)番茄枯萎病菌有極強(qiáng)的抑制作用,且抑菌物質(zhì)對(duì)高溫高壓不敏感,100 ℃熱處理后抑菌活性基本沒有降低,而121 ℃高溫高壓處理后抑菌活性仍在80%以上。

A.對(duì)照番茄枯萎病菌正常孢子及菌絲;B.加入Pb-4

處理Treat-ments菌液量/mLBacterialfluidvolume培養(yǎng)時(shí)間/dCulturetime1357平均值MeanD1/mmR1/%D1/mmR1/%D1/mmR1/%D1/mmR1/%R1/%018.1±0.4Aa84.610.1±0.5Aa87.911.2±0.2Aa92.412.0±0.3Aa92.489.31110.0±0.2Aa69.215.4±0.2Bb72.716.2±0.2Bb84.818.3±0.3Bb84.877.9219.4±0.4Aa76.911.3±0.4Bb84.812.2±0.3Cc90.913.2±0.2Cc91.185.93110.0±0.2Bb69.212.1±0.1Cc81.814.2±0.4Cc87.915.2±0.3Dd88.681.9027.1±0.4Aa92.39.1±0.5Aa90.910.2±0.2Aa93.910.0±0.3Aa94.993.0129.0±0.2Aa76.912.4±0.2Bb81.813.2±0.2Aa89.416.3±0.3Bb87.383.9228.4±0.4Aa84.69.3±0.4BCbc90.910.2±0.3Bb93.910.2±0.2Cc94.991.1329.0±0.2Bb76.910.1±0.1Cc87.912.2±0.4Bb90.913.2±0.3Cc91.186.7CK-19.1±0.4Cc-39.0±0.4Dd-73.3±0.8Dd-79.8±0.8Ee

注:D1為菌落直徑/mm;同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示在P<0.01和P<0.05水平下差異顯著。表3同。

Note:D1.Colony diameter;In the same column the data following different letters mean significant difference atP<0.01 andP<0.05 levels.The same as Tab.3.

表3　Pb-4菌培養(yǎng)液對(duì)番茄枯萎病菌的相對(duì)抑菌活性

注:表中D2為抑菌圈直徑/mm。

Note:D2.Inhibitionzone diameter.

2.5Pb-4菌抗菌蛋白粗提液的抗菌活性鑒定

取培養(yǎng)48 h的Pb-4菌液,15 000 r/min離心15 min,得上清液;在上清液中加入粉狀硫酸銨,使硫酸銨飽和度達(dá)到80%,4 ℃冰箱過夜。次日,10 000 r/min離心15 min,棄上清,用適量的Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L,pH值7.5)溶解沉淀。然后用同一緩沖液透析48 h(4 ℃),PEG6000濃縮,制得粗提蛋白液(4-1);將粗提蛋白在沸水100 ℃保溫15 min(4-2);粗提蛋白在121 ℃高溫高壓處理15 min(4-3)。分別將上清液、蛋白粗提液(4-1)、100 ℃處理的蛋白液(4-2)和121 ℃處理蛋白液(4-3),進(jìn)行抑制病原菌活性檢測(cè)(圖3)。結(jié)果表明,抑菌圈直徑分別是10.53,19.89,17.55,15.32 mm,高溫100，121 ℃處理后的抑菌活性分別是未處理蛋白的88.2%和77.0%。蛋白粗提液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,初步確定抗菌蛋白分子量為 14.4,45.0 kDa(圖4)。

圖3　Pb-4菌不同處理蛋白粗提液的抗菌活性鑒定

圖4　Pb-4菌抑菌蛋白凝膠電泳圖

2.6Pb-4菌非蛋白拮抗物(抗菌素)的提取及活性檢測(cè)結(jié)果

用乙醚、苯提取的活性物質(zhì),自然風(fēng)干后為灰白色結(jié)晶。通過瓊脂平板擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性,結(jié)果顯示,無水乙醇、乙醚和苯對(duì)番茄枯萎病菌沒有影響,而用乙醚和苯提取的活性物質(zhì)K1,K2的拮抗活性較高,抑菌圈較大,抑菌效果明顯(圖5)。

圖5　Pb-4菌乙醚、苯提取物的抑菌活性檢測(cè)

2.7Pb-4菌β-1,3-葡聚糖酶的確定

Pb-4菌株接種于β-1,3-葡聚糖培養(yǎng)基上3 d后,菌株將培養(yǎng)基茯苓粉中的β-1,3-葡聚糖與苯胺藍(lán)結(jié)合生成藍(lán)色,催化水解,呈現(xiàn)無色的水解圈,使藍(lán)色變淺逐漸消失(圖6)。此外,從圖7的β-1,3-葡聚糖酶凝膠電泳圖中可以看到,電泳條帶清晰,可以初步確認(rèn),該菌株具有β-1,3-葡聚糖酶活性。

圖6　Pb-4菌產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶的確定

圖7　Pb-4菌產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶凝膠電泳

3結(jié)果與討論

芽孢桿菌內(nèi)生芽孢,繁殖能力強(qiáng),有利于工業(yè)化生產(chǎn),又是自然界中廣泛存在的非致病細(xì)菌,對(duì)人畜無害,不污染環(huán)境。因此,自1945年Johnson等報(bào)道枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)后[33],半個(gè)多世紀(jì)以來各國(guó)的研究工作者對(duì)它可望成為一種生物控制因素而寄予極大的希望和關(guān)注。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)大多為低分子抗生素以及蛋白或多肽類化合物[34]。本課題組分離保存的芽孢桿菌Pb-4能夠抑制多種植物病原真菌,經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。其發(fā)酵液中至少含有2種以上的抗菌活性物質(zhì),分離得到的活性物質(zhì)具有極強(qiáng)的抑菌活性,所產(chǎn)生的抑菌圈大于有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的拮抗菌種,而且具有很多優(yōu)良的特性,含有抗菌蛋白、抗生素類活性物質(zhì)和β-1,3-葡聚糖酶等多種可抑制真菌病原菌生長(zhǎng)的抗菌物質(zhì),其中,抗菌蛋白分子量為 14.4,45.0 kDa,這與張寶俊等[31](20.3 kDa)、田祖光[35](35 kDa)、王納賢[36](13 kDa),劉蓮娜等[37](50 kDa)的報(bào)道均有不同,可能是由于不同的菌株其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的基因不同,或由于試驗(yàn)條件、材料、測(cè)試方法等不同引起的,且目前均未對(duì)這些抗菌蛋白的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究,今后將對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。此外,Pb-4菌發(fā)酵液還具有很好的熱穩(wěn)定性,經(jīng)100,121 ℃熱處理后的抑菌活性仍可達(dá)到98.9%和80.1%,其熱穩(wěn)定性較文獻(xiàn)報(bào)道的要高,熱處理后所含抑菌物質(zhì)成分還有待于進(jìn)一步研究確定。

我國(guó)近幾年才開始進(jìn)行解淀粉芽孢桿菌在抑制病原菌方面的研究,武翠紅[38]、冉曉瀟[39]、楊娜[40]、曲春鶴[41]、雷白時(shí)[42]等,分別研究了解淀粉芽孢桿菌對(duì)棉花黃萎病、山茶灰斑病、白菊枯萎病、辣椒根腐病、西瓜枯萎病等病菌的拮抗作用,而就本課題組分離的具有多種抗菌物質(zhì)、可抑制多種病原菌的耐熱型解淀粉芽孢桿菌在防治番茄枯萎病的應(yīng)用上還未見報(bào)道。有關(guān)Pb-4菌株的定殖、田間防病應(yīng)用目前也已進(jìn)行了深入研究;此外,在田間試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Pb-4菌株不僅對(duì)病菌有抑制作用,而且對(duì)植株的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,因此,對(duì)Pb-4菌株的促生長(zhǎng)作用也將進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果將為Pb-4菌的擴(kuò)大生產(chǎn)和在農(nóng)業(yè)病原菌防治中的廣泛應(yīng)用提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

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Identification ofBacillussp. Pb-4 and Its Unitilization for Antimicrobial Activity

GUO Jun1,WU Ailian1,YAN Min1,LI Wei1,CHI Xiurong2,DING Yuchuan1,JIAO Xiaoyan1

(1.Institute of Agricultural Environment & Resource,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of Soil Environment & Nutrient Resources,Taiyuan030031,China;2.Beijing Seed Administration Station,Beijing100088,China)

Abstract：A bacillus strain,named as Pb-4,which showed significant antagonistic activity against to many plant pathogenic fungi.The study was in order to determine the taxonomic status and antimicrobial mechanism of Pb-4.The strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens based on its morphological and physiological properties and its 16S rRNA sequence.The antibacterial activity was characterized by plate two-way cultivation.Antibacterial compound from the identified strain was separated and purified by ammonium sulfate precipitation,diethyl ether and benzene abstract.Bacillus amyloliquefaciens was isolated that not only has antibacterial activity against F.oxysporum tomato,F.oxysporum cucumber, F.oxysporum watermelon and F.oxysporum green pepper;but also against Phytophthora capsici Leonian and Valsa ceratosperma.The bacteria liquid of the Pb-4 strain showed that strong antifungal activity against spore germination and hyphal growth of tomato wilt pathogen.The bacteria fluid to fusarium wilt diseases of tomato inhibition of growth rate was 93%.The antimicrobial activity of 100,121 ℃ high temperature treatment of untreated bacteria liquid of 98.9% and 80.1%.From the bacteria liquid extract of proteins,enzymes,and antibiotic active substances,had strong growth inhibition effect for Fusarium oxysporum.The results can provide a strong theoretical basis for the wide application of Pb-4 in the prevention and control of agricultural pathogenic bacteria.

Key words:Bacillus amyloliquefaciens;Fusarium wilt;Antagonistic bacteria;Antimicrobial activity

doi:10.7668/hbnxb.2016.02.036

中圖分類號(hào)：S432

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)02-0224-07

作者簡(jiǎn)介：郭珺(1974-),女,山西原平人,副研究員,碩士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物資源利用研究。通訊作者：焦曉燕(1964-),女,山西臨猗人,研究員,博士，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)研究。

基金項(xiàng)目：山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20120311009-2);山西省財(cái)政支農(nóng)項(xiàng)目(2014NYST-01);山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目(YZD0907)

收稿日期：2016-02-02