何首烏對血管性認知障礙大鼠學習記憶功能的影響

王洲羿，夏光明，周　剛，肖展翅，黃虎翔，陳浩特，李　鋼

湖北省黃岡市中心醫院(湖北黃岡 438000)

?

何首烏對血管性認知障礙大鼠學習記憶功能的影響

王洲羿，夏光明，周剛，肖展翅，黃虎翔，陳浩特，李鋼

湖北省黃岡市中心醫院(湖北黃岡 438000)

摘要：目的探討何首烏對血管性認知障礙(VCI)大鼠學習記憶功能的影響。方法篩選造模成功VCI大鼠48只，隨機分為4組：何首烏高劑量組、何首烏中劑量組、何首烏低劑量組、VCI模型組，每組12只大鼠。另有12只假手術大鼠作為正常對照組(假手術組)。造模成功后對大鼠用灌胃器灌胃，灌胃液體溫度為20 ℃，何首烏高、中、低劑量組給予4.0 g/mL、2.0 g/mL、0.5 g/mL何首烏溶液灌胃，模型組、假手術組均生理鹽水灌胃，灌胃劑量按1 mL/(100 g·d)，共28 d。術后28 d各組大鼠開始行Morris水迷宮學習記憶能力等行為學測試，行為學測試結束后，行免疫組織化學檢測Bcl-2、Bax陽性細胞的表達。結果與VCI模型組相比，何首烏中劑量組、何首烏高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越目標象限時間明顯延長，穿越平臺次數明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05 或P<0.01)；各組VCI大鼠造模28 d完成行為學試驗后海馬區Bcl-2和Bax蛋白表達顯著高于假手術組。而何首烏高劑量組、中劑量組與VCI模型組相比Bcl-2蛋白表達增加的幅度明顯大于Bax蛋白(P<0.05或P<0.01)。結論何首烏通過調節Bcl-2、Bax蛋白表達來抑制細胞凋亡，從而改善VCI大鼠的學習以及認知能力。

關鍵詞：血管性認知障礙；何首烏；學習記憶功能；Bcl-2；Bax；呆病

血管性認知障礙(VCI)是伴隨著腦血管病的發生出現的一種記憶、認知和行為等障礙的綜合征，其中較為嚴重的又稱血管性癡呆(VD)。隨著我國老齡人口的不斷增多，血管性癡呆這一問題日益突出。與阿爾茨海默病(AD)等其他認知功能障礙疾病不同，VCI是一種可預防、可延緩認知損害進程，甚至可逆轉的綜合征[1]。這提示人們應該把重點放在對VCI的長期診治和預防干預上來。因此，在充分認識VCI的基礎上。在VCI初期發展到VD之前，就做到早期預防、早期診斷、早期治療，阻止病情發展，無疑對預防和控制VD的發生和發展有著重要的現實意義。因此開發研究確實有效的預防治療藥物非常迫切。何首烏(Polygonum Multiflorum Thunb)是祖國醫學中抗衰老之中藥，據《本草綱目》記載何首烏有“益精髓、延年不老”之效。本研究擬建立VCI大鼠模型，通過何首烏對模型大鼠的治療，從其行為學和分子生物學水平分析血管性認知障礙大鼠發病機制。

1材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠80只，SPF級，體重(200±20)g，雌雄各半，湖北省黃岡市中心醫院實驗動物中心提供。大鼠購買后，養殖于自然光線下，保持溫度20 ℃～25 ℃，自由進食進水，適應性飼養1周。

1.2受試藥物何首烏藥材由本課題組所在單位藥劑科提供，原藥材經該單位質檢部鑒定為蓼科植物何首烏的塊根，其質量符合《中國藥典》2010版何首烏項下規定。制首烏飲片由本實驗室人員自行炮制并檢測，其質量符合《中國藥典》2010版制何首烏項下規定。受試藥物提取制備：取制首烏飲片粗粉，先用80%乙醇熱提取兩次，提取液用旋轉蒸發儀濃縮，除去乙醇后加水配制成相當于制何首烏4.0 g/mL、2.0 g/mL、0.5 g/mL 3種高、中、低劑量濃度的溶液。

1.3儀器與試劑MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統，成都泰盟科技有限公司；熒光多功能顯微鏡：BX，日本OLYMPuS公司；CMIAS圖像分析儀：CMIAS 98A，北京航空航天大學；石蠟切片機：RM2145，德國LEICA公司；image-pro plus圖像處理系統6.0，美國Media Cybernetics公司。免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.4實驗方法

1.4.1VCI大鼠的造模方法采用反復結扎雙側頸總動脈(CCA)造成缺血再灌注損傷(2VO)建立大鼠VCI模型[2]。腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，鈍性分離雙側CCA，用動脈夾夾閉雙側CCA造成腦缺血，夾閉10 min，再灌注20 min，反復3 次，縫合切口，術后行抗感染治療。假手術組只行CCA分離，不夾閉血管。

1.4.2分組及給藥方法篩選術后造模成功大鼠48只，隨機分為4組：何首烏高劑量組、何首烏中劑量組、何首烏低劑量組、VCI模型組，每組12只大鼠。另有12只假手術大鼠作為正常對照組(假手術組)。造模成功后對大鼠用灌胃器灌胃，灌胃液體溫度為20 ℃，何首烏高、中、低劑量組分別給予4.0 g/mL、2.0 g/mL、0.5 g/mL何首烏溶液灌胃，模型組、假手術組均給予生理鹽水灌胃，灌胃劑量按1 mL/(100 g·d)，共28 d。

1.4.3學習記憶能力測定采用Morris水迷宮方法[3]。實驗前將大鼠放入水中進行適應性訓練。術后28 d各組大鼠開始行Morris水迷宮實驗：①定位航行實驗，歷時5 d，每天4次，大鼠面向池壁從A、B、C、D入水點放入水中，觀察其在2 min內尋找到并爬上平臺的時間(逃避潛伏期)，若2 min未找到平臺，實驗者將其牽引至平臺上，停留10 s后放回籠中，潛伏期記為最高2 min。②空間探索實驗：第6天撤除平臺，任選一個入水點放入大鼠，測量2 min內大鼠在目標象限和其他象限的游泳時間、穿越目標(原平臺)次數[4]。

1.4.4免疫組織化學檢測Bcl-2、Bax陽性細胞的表達行為學測試結束后，各組大鼠行心臟灌注術，以0.4%的戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)腹腔麻醉，立即開胸暴露心臟。左心室迅速插管至主動脈，同時剪開右心室，灌注生理鹽水，速度先快后慢，直至舌尖、肝臟變白，大鼠四肢僵硬為滿意，迅速取腦，立即將腦置于4%多聚甲醛中浸置4 h～6 h，取視交叉后4 mm處至小腦前的腦組織，PBS漂洗，經乙醇常規脫水、二甲苯透明后，浸蠟包埋，5 mm厚切片，行免疫組化染色。

2結果

2.1何首烏對大鼠認知功能的影響

2.1.1定位航行實驗隨著訓練次數增多，各組大鼠逃避潛伏期均有不同程度縮短。與假手術組相比，VCI模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)；而與VCI模型組相比，何首烏中劑量組、何首烏高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1　各組大鼠逃避潛伏期比較(±s) 　 s

2.1.2空間探索實驗與假手術組相比，VCI模型穿越目標象限時間明顯縮短(P<0.01)，穿越平臺次數明顯減少(P<0.01)；與VCI模型組相比，何首烏中劑量組、何首烏高劑量穿越目標象限時間明顯延長，穿越平臺次數明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2　各組大鼠空間探索實驗結果比較(±s)

2.2各組大鼠海馬Bcl-2、Bax免疫組化結果Bcl-2、Bax免疫陽性細胞胞漿內出現棕黃色顆粒，即免疫組化染色的陽性表達成分。VCI模型組陽性細胞著色增強，數量明顯增加，其中Bax變化更為顯著，Bcl-2/Bax的比值較假手術組明顯降低。何首烏高劑量組、何首烏中劑量組Bcl-2、Bax陽性細胞也有增加，著色增深，尤其Bcl-2變化顯著，Bcl-2/Bax的比值較假手術組明顯增高。何首烏低劑量組與VCI模型組比較無顯著意義(P>0.05)。詳見表3。

表3　各組大鼠海馬Bcl-2、

3討論

VCI是指由腦血管病危險因素、明顯或不明顯的腦血管病引起的，從輕度認知功能損害到癡呆的一大類綜合征，涵蓋了VCI從輕到重的整個發病過程。腦部微循環障礙導致神經元凋亡是其發生的共同通道[5]，主要病理變化是認知相關腦區如額葉、顳葉、杏仁體、丘腦等處明顯的血管性病變、局灶性神經元損傷和腦白質損傷[6]。隨著年齡的增長，VCI的發病率和患病率有逐漸增加的趨勢[7]。

VCI屬中醫“呆病”范疇，基本病機是腎精虧虛、瘀血阻絡，治療當以補腎填精、化瘀通竅為主。何首烏是傳統醫學中常用來益智、抗衰老、改善記憶力的名貴中草藥。二苯乙烯苷是何首烏中特有的生物活性成分，其含量目前已經成為何首烏藥材的專屬性指標，其具有抗氧化、清除自由基、降血脂、抗動脈粥樣硬化及促智等作用。相關研究表明，何首烏對丘腦神經元有保護、改善學習記憶的作用[8]。

Bcl-2家族是細胞凋亡機制中重要的調節因子，Bcl-2、Bax是這一家族中重要成員，根據結構和功能分為凋亡抑制因子和促凋亡誘導因子，其中Bcl-2是最主要的凋亡抑制因子，而Bax是最主要的凋亡促進因子[9]。Bcl-2基因是一種重要的內源性抗凋亡因子，過度表達后可抑制由于氧自由基、興奮性氨基酸等誘發的神經細胞凋亡。Bax為重要促凋亡基因，其誘導凋亡的機制是Bax同源二聚體的形成，Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用則要通過與Bax結合形成異源二聚體來實現[10]。

本實驗行為學結果顯示，術后28 d VCI模型大鼠出現明顯的學習記憶障礙，表現為逃離潛伏期的延長和在目標象限中游泳時間的縮短以及穿越平臺次數的減少。而與VCI模型組相比，何首烏中劑量組、何首烏高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越目標象限時間明顯延長，穿越平臺次數明顯增加，表明中、高劑量何首烏對VCI模型大鼠的學習以及認知能有一定改善作用。而在本實驗中各組VCI大鼠造模28 d完成行為學試驗后，海馬區Bcl-2和Bax蛋白表達顯著高于假手術組。而何首烏高劑量組、中劑量組與VCI模型組相比，Bcl-2蛋白表達增加的幅度明顯大于Bax蛋白，即雖然Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達均升高，但Bcl-2蛋白增加的更為明顯，發揮了Bcl-2作為內源性神經保護物質高表達后抑制神經元凋亡的作用。本研究提示，何首烏通過調節Bcl-2、Bax蛋白表達來抑制細胞凋亡，從而改善VCI大鼠的學習以及認知能力。對臨床中延緩VCI向VD發展有著重要意義；同時對何首烏以及何首烏為主的傳統名方的挖掘、中藥治療慢性疾病以及新藥的開發都有著重要的指導意義。

參考文獻：

[1]賈建平，魏翠柏．血管性認知損害——預防重于治療[J]．中國現代神經疾病雜志，2010，10(3)：277-278．

[2]Jiwa NS，Garrard P，Hainsworth AH.Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment：a systematic review[J].J Neurochem，2010，115(4)：814-828.

[3]葉翠飛，張麗，艾厚喜，等．兩種水迷宮實驗對擬癡呆模型動物學習記憶功能測試的比較[J]．中國行為醫學科學雜志，2004，13(3)：256-261．

[4]胡意員，周利飛，何金彩，等.長期高脂飲食對大鼠認知功能及情緒的影響[J].溫州醫學院學報，2013，43(4)：241-244；248.

[5]Tomimoto H.Vascular cognitive impairment：the relationship between hypertensive small vessel disease and cerebral amyloid angiopathy[J].Brain Nerve，2012，64(12)：1377-1386.

[6]Gorelick PB，Pantoni L.Advances in vascular cognitive impairment[J].Stroke，2013，44(2)：307-308.

[7]Rockwood K，Howard K，Mac Knight C，et al.Spectrum of disease in vascular cognitive impairment[J].Neuroepidemiology，1999，18：248-254.

[8]易傳安，汪冶，胡祥上，等.何首烏提取物對血管性癡呆大鼠5-HT受體及生化指標的影響[J].中國老年學雜志，2014，34(2)：945-947.

[9]Tichy A．Apoptotie machinery：the Bcl-2 family protein in the roleof inspectors and superintendents[J].Acta Medica(Hradec Kralove)，2006，49(1)：13-18．

[10]Zhu Y，Prehn JH，Culmsee C，et al．111e beta2-adrenoceptor agonistclenbuterol modulates Bcl-2，Bcl-2 and Bax protein expression following transient forebrain ischemia[J]．Neuroscience，1999，90(4)：1255．

(本文編輯郭懷印)

The Influence of Polygonum on Learning and Memory Function in Rats with Vascular Cognitive Impairment

Wang Zhouyi，Xia Guangming，Zhou Gang，Xiao Zhanchi，Huang Huxiang，Chen Haote，Li Gang

Huanggang Central Hospital，Huanggang 438000，Hubei，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the impact of polygonum on learning and memory function in rats with vascular cognitive impairment(VCI).MethodsForty-eight VCI model rats were randomly divided into four groups，namely polygonum high dose group，middle dose group，low dose group，VCI model groups.Another 12 sham-operated rats served as normal controls.After a successful modeling by gavage to rats is fed，fed a liquid temperature of 20 ℃，polygonum each treatment group were given different groups according to different concentrations of Polygonum solution mice in the model group，sham group were normal saline irrigation stomach，a total of 28 days.After 28 days the rats began to Morris water maze learning and memory ability behavioral tests，behavioral tests after the end of the line expression of Bcl-2 immunohistochemistry，Bax positive cells.ResultsCompared with the model group，escape latency was significantly shorter in polygonum middle dose group，high dose group(P<0.05 or P<0.01).The time of crossing the target quadrant was prolonged，the number of across the platform increased significantly(P<0.05 or P<0.01).After 28 days of modeling，the expressions of hippocampus Bcl-2 and Bax protein in each group was significantly higher than that in sham group.Compared with the model group，the magnitude of the increase Bcl-2 protein expression was significantly greater than the Bax protein in polygonum middle dose group，high dose group(P<0.05 or P<0.01).ConclusionPolygonum can inhibit apoptosis by regulating the Bcl-2，Bax protein expression，and improve the learning and cognitive ability in rats with VCI.

Key words：vascular dementia；polygonum；learning and memory function；Bcl-2；Bax

(收稿日期：2015-12-16)

Corresponding Author：Li Gang

中圖分類號：R749.1R285.6

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.011

文章編號：1672-1349(2016)09-0960-03

通訊作者：李鋼，E-mail：38449259@qq.com

基金項目：湖北省自然科學基金面上項目(No.2013CFC053)