微小RNA(miR)-155對脂多糖所致小鼠急性肺損傷的干預作用

馬　丞　阿賽古麗

(西北民族大學醫學院，甘肅　蘭州　730030)

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微小RNA(miR)-155對脂多糖所致小鼠急性肺損傷的干預作用

馬丞阿賽古麗

(西北民族大學醫學院，甘肅蘭州730030)

〔摘要〕目的探討微小RNA(miR)對脂多糖(LPS)所致小鼠急性肺損傷的干預作用。方法35只SPF級雄性C57小鼠隨機分為LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強組、空白對照組，每組7只?？瞻讓φ战M不做任何處理；另外四組小鼠建立LPS急性肺損傷模型，LPS致傷后45 min，LPS致傷組行氣管穿刺注入生理鹽水，miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強組分別注入0.02 nmol/μl相應試劑5 μl。24 h后取完整肺組織，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察組中形態，實時定量PCR檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β mRNA表達情況，Taqman探針法檢測miR-155表達情況，Western印跡法檢測環氧化酶(COX)-2蛋白表達情況。結果LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強組中TNF-α、IL-1β mRNA表達水平明顯高于空白對照組(P<0.05)，miR-155增強組明顯低于LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組(P<0.05)。miR-155增強組miR-155表達水平明顯高于LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組(P<0.05)?？瞻讓φ战MCOX-2蛋白表達量明顯低于另外四組(P<0.05)。結論miR-155可明顯減弱LPS所致的小鼠急性肺損傷炎癥反應。

〔關鍵詞〕急性肺損傷；微小RNA；脂多糖

目前急性肺損傷多集中于發病機制和藥物機制方面，尚缺乏主動特異性治療方法，而特異性治療對于機體功能偏低的老年急性肺損傷患者具有更重要的意義。相關研究顯示，通過抑制炎性反應和放大效應來控制病情進展具有較好的可行性〔1〕。微小RNA(miR)是近年來國內外基因調控領域的研究焦點，已證實其參與到炎癥的發生、發展過程〔2〕。本次研究建立脂多糖(LPS)小鼠急性肺損傷模型，氣管給藥后檢測肺組織中炎性介質表達情況，擬探討miR-155對急性肺損傷的干預作用。

1材料與方法

1.1動物及材料健康SPF級雄性C57小鼠35只，體重(22±2)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。Trizol試劑(南京安培化工科技有限公司)；miR-155增強劑、抑制劑、對照劑(北京泰澤瑞達科技有限公司)；腫瘤壞死因子(TNF)-α引物、白細胞介素(IL)-1β引物(南京森貝伽生物科技有限公司)；miR-155反義探針、U6反義探針、LPS(Sigma公司)；Taq-man miR實時熒光定量試劑盒、miR逆轉錄試劑盒(深圳盎然生物科技有限公司)；美國ABI 7500型實時熒光定量儀，德國Eppendorf高速低溫離心機。

1.2方法

1.2.1分組及建立模型將35只C57小鼠隨機分為LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強組、空白對照組，每組7只?？瞻讓φ战M不做任何處理；另外四組小鼠按5 mg/kg劑量腹腔注射1%的戊巴比妥鈉，麻醉后切開小鼠頸部皮膚和組織暴露氣管，行氣管穿刺按4 mg/kg劑量向肺中注入20 μg/μl的LPS建立急性肺損傷模型。LPS致傷后45 min，LPS致傷組行氣管穿刺注入生理鹽水，miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強組分別注入0.02 nmol/μl相應試劑5 μl，頸部皮膚縫合。五組小鼠繼續喂養24 h后麻醉，取完整肺組織后斷髓處死。

1.2.2標本采集和處理將小鼠左肺上葉在10%的甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，4 μm連續切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察肺組織損傷程度。剩余的肺組織剪成邊長為1 mm的正方體小塊，錫紙包裹后-80℃保存，用于提取組織蛋白和RNA。

1.2.3TNF-α、IL-1β mRNA、miR-155表達取小塊肺組織，勻漿后Trizol法提取總RNA。采用綠色熒光染料法實時定量PCR擴增，檢測TNF-α、IL-1β mRNA表達情況。cDNA合成條件：37℃、20 min，98℃、10 min，4℃保存；反應體系10 μl，其中包括2 μl逆轉錄緩沖液、1 μl逆轉錄酶、1 μl P混合液、6 μl RNA，5倍稀釋備用。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。常規反應條件下40個循環擴增后繪制溶解曲線，定量分析。采用Taqman探針法實時定量PCR檢測miR-155表達情況。cDNA合成條件：16℃、40 min，42℃、5 min，85℃、5 min，4℃保存；反應體系15 μl，100 mmol三磷酸堿基脫氧核苷酸0.2 μl，1 μl逆轉錄酶、2 μl 緩沖液、6 μl RNA，5倍稀釋備用。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。反應條件：95℃預變性5 min，95℃ 20 s，60℃ 40 s，40個循環。擴增后記錄各組Ct值，定量分析。

1.2.4環氧化酶(COX)-2蛋白表達采用Western印跡法檢測：取小塊肺組織，加RIPA蛋白裂解液，提取組織蛋白，蛋白裂解液稀釋至25 mg/ml。按3∶1體積加緩沖液，水浴20 min，聚丙烯酰胺(PAGE)膠電泳后轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉Tris-HCl緩沖液(TBST)封閉60 min。加兔抗鼠COX-2(1∶2 000)，4℃孵育過夜，Tween20/TBS溶液洗滌3次，15 min/次；加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔單克隆抗體，4℃孵育過夜，Tween20/TBS溶液洗滌3次，加發光液，反應10 min后暗室曝光、顯影、定影。β-肌動蛋白為內參，Image-Pro Plus軟件測定蛋白表達情況。

1.3統計學方法采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2結果

2.1各組小鼠肺組織病理學變化空白對照組小鼠肺泡結構完整、大小均勻，肺泡腔和肺間質未見明顯炎細胞浸潤。LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組均存在毛細血管充血，肺間質水腫，肺泡腔存在明顯炎性細胞浸潤；miR-155增強組肺泡間充血程度，肺泡壁損傷和炎性細胞浸潤程度輕于LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組。見圖1。

2.2各組小鼠TNF-α、IL-1β mRNA、miR-155表達情況LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強組中TNF-α、IL-1β mRNA表達水平均明顯高于空白對照組(P<0.05)，造模成功。miR-155增強組TNF-α、IL-1β mRNA表達水平明顯低于LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組(P<0.05)。miR-155增強組miR-155表達水平明顯高于LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組(P<0.05)。見表1。

圖1　各組小鼠肺組織病理學變化情況(HE，×40)

組別TNF-αIL-1βmRNAmiR-155LPS致傷組25.58±4.531)2)56.85±4.611)2)0.83±0.102)miR-155抑制組39.81±4.321)2)63.82±5.081)2)1.18±0.462)miR對照組37.10±4.971)2)60.18±5.371)2)0.91±0.292)miR-155增強組13.67±3.171)26.44±4.381)165.26±17.95空白對照組1.15±0.521.22±0.551.03±0.37

與空白對照組相比：1)P<0.05；與miR-155增強組相比：2)P<0.05

2.3各組小鼠COX-2蛋白表達水平比較空白對照組COX-2蛋白表達量為(0.74±0.08)；LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強組COX-2蛋白表達量分別為(1.05±0.07)、(1.07±0.10)、(1.02±0.04)、(0.88±0.08)?？瞻讓φ战MCOX-2蛋白表達量明顯低于另外四組(P<0.05)。見圖2。

1～5分別為：LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強組、空白對照組圖2　Western印跡檢測各組小鼠肺組織中COX-2蛋白表達

3討論

miR可維持生物機體穩定狀態，調節生長發育，影響疾病的發生、發展。研究顯示，miR-155可參與機體對炎性介質的免疫應答，維持免疫功能的正常〔3〕。相關基礎研究認為，miR-155作用于靶基因抑制性KB激酶(IKK)家族相關死亡域蛋白，減弱核轉錄因子(NF)-κB活性，按照次級效應方式對炎性因子的釋放產生抑制效果，降低機體損傷〔4〕。由于大鼠miR給藥劑量較大，為控制研究成本，本次研究采用小鼠急性肺損傷模型，與以往該領域多數采用的急性肺損傷實驗大鼠模型不同。急性肺損傷病理生理過程中會分泌大量的炎性因子(如TNF-α、IL-1β)〔5〕。COX-2蛋白是發生炎性反應的關鍵酶，當多種刺激因素作用于細胞時，其表達水平明顯上升〔6〕。本文顯示，LPS會導致小鼠肺組織分泌大量TNF-α、IL-1β，COX-2蛋白表達也明顯上調，在給予小鼠氣管注射miR-155增強劑后，TNF-α、IL-1β mRNA和COX-2蛋白表達均降低，但轉染miR-155抑制劑之后上述指標表達不明顯，可能與miR-155基礎量不高有關；HE染色結果說明miR-155能夠有效抑制LPS引發的急性肺損傷炎性反應。相關研究顯示，miR-155靶向抑制髓樣分化因子為NF-κB信號通路的連接蛋白，能夠對幽門螺旋桿菌導致的炎性反應起到負調控作用〔7〕。在急性肺損傷模型中，miR-155能否通過抑制髓樣分化因子減弱炎性反應，需進一步研究。

4參考文獻

1Lai TS，Wang ZH，Cai SX.Mesenchymal stem cell attenuates neutrophil-predominant inflammation and acute lung injury in an in vivo rat model of ventilator-induced lung injury〔J〕.Chin Med J，2015；128(3)：361-7.

2Kuiper JW，Pl?tz FB，Groeneveld AJ,etal.High tidal volume mechanical ventilation-induced lung injury in rats is greater after acid instillation than after sepsis-induced acute lung injury，but does not increase systemic inflammation：an experimental study〔J〕.BMC Anesthesiol，2013；11(1)：26.

3李波.小鼠急性肺損傷時期促炎癥消退介質脂氧素的變化及調節機制研究〔D〕.武漢：華中科技大學，2013.

4李昕輝，滕飛.白細胞介素23基因沉默對支氣管哮喘小鼠的影響〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2015；16(1)：38-42.

6韓丙超.汽化吸入全氟化碳對內毒素性急性肺損傷兔表面活性蛋白和基質金屬蛋白酶的影響〔D〕.北京：軍醫進修學院，2012.

7劉振寧.PPAR-γ激動劑對百草枯致大鼠急性肺損傷的保護作用及機制研究〔D〕.沈陽：中國醫科大學，2013.

〔2015-08-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項目：甘肅省高等學校科研項目(No.2014A-088)

通訊作者：阿賽古麗(1972-)，女，博士，教授，主要從事臨床醫學實驗研究。

〔中圖分類號〕R563

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09--；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.006

第一作者：馬丞(1993-)，男，碩士，主要從事臨床醫學實驗研究。